比较甲基化Sept9与其他标志物对结直肠癌诊断价值的meta分析

邓翰林，张剑波，顾海涛，王继见

(重庆医科大学附属第二医院胃肠肛肠外科，重庆 400010)

0 引言

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是全球第三常见的恶性肿瘤，其预后与诊断的分期高度相关[1]。因此，尽早诊断结直肠癌是提高患者生存率及减轻社会经济负担的关键。目前较常见的用于CRC筛查的无创方法是粪便潜血试验(fecal occult blood test，FOBT)和癌胚抗原(CEA)检测。然而，这些方法的灵敏度及特异度相对不足，在一定程度上限制了其在CRC筛查中的应用。结肠镜检测是CRC筛查的有效方式，具有非常高的诊断价值，但其是一种侵入性检查，需要肠道准备，侵犯了患者的隐私，依从性低，会给病人带来潜在的风险，并且不利于CRC的广泛筛查。因此需要一种较高灵敏度和特异度的、更少侵袭性的、几乎不需要准备的、患者易接受的可供选择的方式筛查CRC。

DNA甲基化是CRC中研究最广泛的表观遗传学过程之一，CRC特异性甲基化基因的研究为开发生物标志物提供了各种新的机遇[2]。在大肠癌发生过程中，Septin9基因V2转录物启动子区的CpG岛3高甲基化，并且该基因的DNA从坏死和凋亡的癌细胞释放到外周循环血中[3]。基于外周血的甲基化Septin9(methylated Sept9，mSept9)检测旨在检测从CRC细胞释放到外周血的Septin9基因DNA启动子区域的异常甲基化[4]。因此，通过检测外周血中Septin9基因特异性启动子区域的DNA甲基化程度，可以评估患结直肠癌的风险。

近年报道，血浆mSept9的灵敏度和特异度在不同研究中差异较大，灵敏度在0.51到0.93之间，特异度在0.62到0.94之间[5-8]。有研究表明，血浆mSept9检测在症状人群中的诊断性可能优于CEA和粪便免疫化学试验[9]。血浆mSept9联合FOBT与单独检测mSept9相比，可能具有更好的诊断表现[10]。血浆mSept9联合其他标志物是CRC筛查的新趋势，在本meta分析中，我们对血浆mSept9的诊断性能进行评估，并且将血浆mSept9与血清CEA、粪便免疫化学试验(The fecal immunochemical test，FIT)或免疫化学粪便潜血试验(immunochemical fecal occult blood test，iFOBT)、mSept9 联合CEA、mSept9联合Fit/iFOBT进行诊断准确性比较，探究血浆mSept9联合CEA或Fit/iFOBT在CRC诊断中的价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

以 PubMed、Embase、Cochrane Library、Web of Science、中国基础设施工程(CNKI)数据库收录的关于比较甲基化Sept9与其他标志物对结直肠癌诊断价值的研究作为研究对象。

1.2 方法

1.2.1 检索策略

本meta分析以系统评价和荟萃分析优先报告条目(PRISMA)为指导进行。两位研究人员独立对数据库进行检索。中文检索词：结直肠癌、甲基化、septin9、sept9、癌胚抗原、粪便潜血试验；英文检索词：methylated、msept9、mseptin9、carcinoembryonic antigen、fecal occult blood test、colorectal cancer。文献检索日期截至2020年1月。

1.2.2 纳入和排除标准

纳入标准：(1)结直肠癌由病理确诊；(2)同时分析外周血血浆mSept9、mSept9联合CEA或者FOBT对大肠癌的诊断价值；(3)研究数据完整，可用于构建2×2表格；(4)包括由良性疾病或健康个体组成的对照组；(5)英文或中文全文文章。排除标准：(1)重复发表；(2)样本小于30；(3)会议论文摘要，综述，案例报告，动物实验等。

1.2.3 文献筛选与数据提取

由两名研究者独立筛选文献、采用标准化表格提取资料并交叉核对，如有分歧，则共同讨论或由第三方协商解决。提取的数据包括：第一作者姓名、发表年份、研究地区、研究类型、患者平均年龄与性别、检测试剂盒、真阳性病例数(truepositives，TP)、假阳性病例数(falsepositives，FP)、假阴性病例数(falsenegatives，FN)、真阴性病例数 (truenegatives，TN)等。

1.2.4 纳入文献的质量评价

按照诊断性试验质量评价(Quality Assessment of Diagnostic Accuracy Studies-2，QUADAS-2)评估纳入文章的方法学质量。QUADAS-2包括病例选择，待评价试验，金标准，病例流程和进展情况四个部分。最后，使用Review Manager 5.3软件对纳入文章的偏倚风险进行评估，并绘制偏倚风险图。

1.3 统计学处理和分析

采用双变量混合效应模型，汇总敏感度、特异度、阳性似然比、阴性似然比和诊断比值比并与95%可信区间(95%confidenceintervals，CI)相结合，同时绘制森林图和综合受试者工作特征曲线(summary receiver operating characteristic，SROC)，利 用 曲 线 下 面 积 (the area under the curve，AUC)来量化诊断试验的准确性。为检测阈值效应，采用Spearman相关系数评价灵敏度与特异度的关系。如果Spearman相关系数的P值大于0.6，则认为异质性是由阈值定义的差异引起[11]。用Q检验和I2检验评估研究的异质性，若I2大于50%为则认为存在显著异质性，并采用回归分析和敏感性分析探究潜在的异质性来源。通过Deek’s漏斗图评估潜在的发表偏倚[12]。所有统计分析均采用Stata SE 15.0软件进行。

2 结果

2.1 文献检索结果

通过初步检索，共获得529篇文献，去除重复文献207篇，然后通过阅读标题及摘要，去除综述、meta分析、信件、非临床研究等文献260篇，再阅读全文，去除非诊断性研究、样本量小于30、未涉及mSept9与其他试验相结合文献33篇，进一步删除不能获得完整统计数据的文献18篇，最后共有10篇文献纳入本meta分析。

2.2 文献质量评价

QUADAS-2用于评估纳入研究的方法学质量，结果见图1。6项的研究是回顾性的，只有2项研究指明患者是随机或是连续的，因此，余下研究的患者选择项被标记为不确定。大部分研究采用了病例对照并且没有避免不恰当的排除。一半的研究未指明待评价试验是否使用盲法。

2.3 纳入文献的基本特征

纳入的10项研究[8，13-21]中，共包括734名CRC患者，均经病理确诊。5项研究[8，13-16]评估了 mSept9、FIT/iFOBT及mSept9联合FIT/iFOBT对CRC的诊断效能。5项研究[17-21]评估了mSept9、CEA及mSept9联合CEA对CRC的诊断效能。有4项前瞻性研究[8,13,16,19]，6项病例对照研究[14,15,17,18,20,21]。纳入文献的基本特点见表1。

2.4 META分析结果

2.4.1 mSept9的诊断效能

10项研究[8，13-21]分析了单独检测mSept9对结直肠癌的诊断价值，其合并灵敏度、特异度、阳性似然比、阴性似然比、诊断比值比分别为 0.70(95%CI：0.63～0.76)、0.93(95%CI：0.86～0.97)、10.7(95%CI：4.9～23.2)、0.32(95%CI：0.26～0.40)、33(95%CI：14～77)。SROC 曲线下面积 (AUC)为：0.84(95%CI：0.81～0.87)。灵敏度及特异度的森林图和SROC曲线见图2AB。

2.4.2 不同诊断方式的比较

5 项 研 究[8，13-16]直 接 比 较 了 mSept9、FIT/iFOBT 和mSept9联合FIT/iFOBT的诊断效能，其合并灵敏度、合并特异度及AUC见表2。通过曲线下面积AUC量化诊断试验的准确性，mSept9、FIT/iFOBT和mSept9联合FIT/iFOBT的AUC 分别为 0.87(95%CI：0.84～0.90)、0.86(95%CI：0.82～0.89)、0.93(95%CI：0.91～0.95)，因此，mSept9 联合 FIT/iFOBT 的诊断效能优于mSept9，而mSept9与FIT/iFOBT的诊断效能相当。

表1 比较mSept9与其他标志物对结直肠癌诊断价值的meta分析纳入文献的基本特征

表2 比较mSept9、FIT/iFOBT和mSept9联合FIT/iFOBT的诊断效能

表3 比较mSept9、CEA和mSept9联合CEA的诊断效能

表4 纳入研究不同临床因素回归分析结果

5项研究[17-21]直接比较了mSept9、CEA和mSept9联合CEA的诊断效能，其合并灵敏度、合并特异度及AUC见表3。通过曲线下面积AUC量化诊断试验的准确性，mSept9、CEA和mSept9联 合 CEA 的 AUC 分 别 为 0.76(95%CI：0.72～0.79)、0.61(95%CI：0.57～0.65)、0.85(95%CI：0.81～0.87)，因此，mSept9 联合 CEA 的诊断效能优于mSept9，同时mSept9的诊断效能优于CEA。

2.5 异质性来源的探讨

mSept9的合并敏感度(I2=75.85，P＜0.001)及特异度(I2=87.42，P＜0.001)均存在显著异质性。Spearman相关系数为0.23(P=0.52)，表明异质性不是由阈值定义的差异引起。使用Deek's漏斗图评估纳入文献不存在发表偏移(P=0.68)，结果见图2C。我们通过单独移除每个研究，然后再次计算汇总统计数据的方式进行敏感性分析，然而没有发现单个研究对整体有明显的影响，敏感性分析表明结果稳健。最后，我们根据纳入研究的研究类型、样本量、联合检测及试剂盒，进行meta回归分析探究潜在的异质性来源，结果见表4。我们发现研究样本量(P=0.01)及联合检测(P=0.02)是敏感度异质性的主要来源，使用的试剂盒(P=0.03)是特异度异质性的主要来源。

3 讨论

通过系统的文献检索，严格的筛选和分析，我们发现血浆mSept9在CRC的诊断中具有中等的灵敏度(0.7)及较高的特异度(0.93)。尽管mSept9联合其他标志物后，其特异度会相对降低，具体结果见表2与表3，但本研究发现血浆mSept9联合FIT/iFOBT和血浆mSept9联合CEA的诊断准确性均优于血浆mSept9单独检测。同时，我们还发现血浆mSept9的诊断准确性优于CEA，而血浆mSept9的诊断准确性与FIT/iFOBT无显著差异。FIT/iFOBT的合并敏感度及特异度与之前发表的研究有所差异[22]，可能是因为粪便潜血试验有两种检测方式，即化学法检测粪便潜血及免疫法检测粪便潜血，本meta分析纳入的研究仅采用免疫法检测粪便潜血，同时本meta分析纳入的研究较少也可能导致差异。

近年来，血浆mSept9已被用于CRC的非侵入性筛查，已有meta分析报告了血浆mSept9联合Fit的诊断价值[10,23]，但其纳入的研究较少，同时报告直接比较mSept9联合FOBT与单独检测msept9的meta分析也较少。此外，评估血浆mSept9联合CEA诊断CRC的meta分析几乎未见报道。血浆mSept9联合其他标志物是提高CRC检出率的有效策略。CEA检测已非常成熟，在结直肠癌的诊断、治疗及随访中占有重要的地位。粪便潜血试验是临床结直肠癌筛查成本最低、最常用的检测方式，但部分人认为谈论、收集和储存粪便样本是不愉快的和尴尬的。一项研究表明，94%的拒绝行FIT的平均风险患者选择了血浆mSept9[24]。同时，德国的一项研究表明，97%的拒绝结肠镜检查的人接受了无创筛查，其中83%的人选择了血浆mSept9[25]。所以血液检测可能更有吸引力，从而导致更高的参与度，即血浆mSept9联合CEA与血浆mSept9联合FIT/iFOBT相比，前者可能更易被人接受。

虽然我们的敏感性分析证实了meta分析结果是稳健的，但不可否认的是我们的研究存在显著的异质性。Spearman相关系数分析表明本研究的异质性不是由阈值定义的差异所造成的。所以我们采用了meta回归分析探究潜在性的异质性来源，meta回归分析提示受试者样本量、联合检测、使用的试剂盒是异质性的潜在来源。本次纳入的研究，有4项研究样本量小于150，样本量较小。本次研究使用的试剂盒分为两类，一类Epi proColon试剂盒，另一类为非Epi proColon试剂盒。而EPI proColon试剂盒本身有两代检测方法和三种算法，而非Epi proColon试剂盒我们不能进一步的其详细信息。

本研究存在一些不足：纳入的研究相对较少，并且大部分为小样本研究；纳入的大部分受试者都来自中国的医院，无法进一步探索mSept9对世界不同地区人群在肿瘤行为方面可能存在的生物学差异；只评估了mSept9对结直肠癌的诊断价值，忽略了其对癌前病变的诊断作用；不能明确非EpiproColon试剂盒具体为何种试剂盒，无法探讨哪种试剂盒的诊断性能最好，以及不同试剂盒对诊断性能的影响；本meta分析不包括除中文和英文以外的任何语言，语言限制可能导致潜在的发表偏倚风险；大多数研究为病例对照研究，排除了“难诊断”的患者，这可能会导致患者选择偏倚和对诊断准确性的过高估计。

综上所诉，血浆mSept9在CRC的诊断中表现出良好的诊断性能。mSept9的诊断效能可能与FIT/iFOBT相似，而mSept9的诊断效能优于CEA。与mSept9相比，mSept9联合FIT/iFOBT或CEA具有更高的诊断准确性，可以更有效地诊断结直肠癌，这为结直肠癌的筛查提供了新的选择。