探究沙棘油对人胃癌细胞HGC-27增殖与凋亡的影响

白鲁根 贺小霞

1.靖边县人民医院检验科，靖边，718500，中国

2.靖边县中医医院，靖边，718500，中国

胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一［1］。P53起初被认为是致癌基因，随着研究的深入，其抑癌功能陆续报道［2］。P53 参与肿瘤的周期调控、细胞凋亡及抑制血管生成等过程［3］。沙棘籽油是从沙棘种子中提取的油液，是一种宝贵的药用植物油，含有多种维生素、生物活性物质以及微量元素，特别是维生素、胡萝卜素、不饱和脂肪酸如亚麻酸、亚油酸、硒在抗肿瘤和增强免疫能力方面有独特的生物活性［4］。近年来中药抗肿瘤已成为科研热点，沙棘油抗肿瘤的作用早在2004年的研究中就发现沙棘油可以诱导人肝癌细胞BEL-7402 凋亡［5］。范磊等研究发现沙棘、肉豆蔻及其组方能够显著抑制人结肠癌细胞HCT-116 增殖并促进其凋亡［6］。但是关于沙棘油在胃癌的作用，目前研究报道较少，有待进一步深入研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

HGC-27 细胞株，由宁夏医科大学基础医学院分子病毒室惠赠；细胞培养液及培养瓶、培养皿，均购自唐山市研壹生物有限责任公司；一抗P53/P21/Bcl-2/β-actin，购自proteintech 公司；二抗，购自中山金桥公司；蛋白提取试剂盒，购自凯基生物公司；细胞计数试剂（cell counting kit-8，CCK-8）细胞活力检测试剂盒，购自北京全式金生物公司；Western Blotting曝光仪，购自AZURE 公司；酶标仪，购自bio-rad公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 实验测定助溶剂DMSO 对HGC-27 细胞活性的影响

本实验使用二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）作为助溶剂溶解沙棘油，通过CCK-8 实验检测DMSO对于HGC-27 细胞安全剂量用于后续实验。将细胞接种于培养瓶加入细胞培养液（5%双抗+10%胎牛血清+85% 1640 培养基）放入5% CO2细胞培养箱内，24 h 后待细胞长满后开始传代，将HGC-27 细胞接种于细胞培养皿内培养，等到细胞生长状态良好时，消化细胞后接种于96 孔板内，每孔接种约5 000 个细胞，培养24 h后加入含不同浓度的DMSO 细胞培养液继续培养，DMSO 浓度梯度依次为0、0.01、0.1、0.5、1、2、2.5、5、10（%），继续在5% CO2细胞培养箱内培养24 h，弃掉原培养液每孔加入不含DMSO 的细胞培养液0.1 mL，同时每孔加入0.01 mL 的CCK-8 检测试剂，继续培养2 h后开始测定吸光度值并记录实验结果，每孔重复3 次，实验重复3 次。

1.2.2 CCK-8 实验测定沙棘油对HGC-27 细胞的影响

通过实验1.2.1 检测出助溶剂DMSO 的安全剂量，使用DMSO 溶解沙棘油溶解于培养液中干预细胞，细胞培养同1.2.1.将HGC-27 细胞接种于96 孔板内，每孔接种约5 000 个细胞，培养24 h 后加入含沙棘油的细胞培养液继续培养，沙棘油浓度梯度依次为0、1、5、10、20、40 μg·mL-1，继续在5% CO2细胞培养箱内培养24 h，弃掉原培养液加入不含血清的细胞培养液0.1 mL，同时加入 0.01mL 的 CCK-8 检测试剂，开始测定吸光度值并记录实验结果。每孔重复3 次，实验重复3 次。

1.2.3 Western Blotting 检测凋亡相关蛋白表达变化

将HGC-27 细胞接种于细胞培养皿内培养，培养12 h，加入含沙棘油的细胞培养液作用24 h 后吸掉换入新鲜培养基，沙棘油使用浓度10、20、40 μg·mL-1，继续培养12 h 后收取细胞并提取蛋白。加样开始电泳，配置SDS-PAGE 蛋白胶，每孔加20 μL 样品，80 V 恒定电压开始电泳待蛋白进入浓缩胶后将电压调至10 V 恒压电泳宜至漠酚蓝跑到底部，停止电泳，进行转膜，条件为300 mA 转模30～50 min，待封闭完成后分别放入一抗中室温孵育2～4 h，其中一抗浓度分别为P53（1∶300）、P21（1∶400）、B 淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（1∶450），洗膜后放入二抗（1∶4 000）中室温孵育1 h，洗膜后加入发光液采集图像，保存数据。

1.3 统计学方法

使用SPSS19.0 分析实验数据，使用GraphPad Prism5.0 作图。原始数据符合正态分布，同时满足方差齐性，则使用t检验或方差分析，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMSO 对胃癌细胞活性影响

使用不同浓度的含DMSO 的细胞培养液干预HGC-27 细胞，实验结果如Fig.1 所示，DMSO 浓度梯度依次为0、0.01、0.1、0.5、1、2、2.5、5、10（%），当DMSO浓度小于等于0.1%时细胞活性较对照组，无显著性差异。当DMSO 浓度分别为10、5、2.5、2、1、0.5（%）时，较对照组，细胞活性显著降低（P<0.05）。提示小于等于0.1% DMSO 细胞培养液对胃癌HGC-27 细胞活性无影响。

Fig.1 The effect of DMSO on the cell viability of gastric cancer HGC-27 cells

2.2 沙棘油对胃癌细胞活性的影响

使用不同浓度含沙棘油培养基干预HGC-27细 胞，结果Fig.2 所示，当沙棘油浓度为5、10、20、40 μg·mL-1干预HGC-27 细胞，均能够较好的抑制HGC-27 细胞的增殖（P<0.05）。

Fig.2 The effect of seabuckthorn oil on the cell viability of HGC-27 cells

2.3 Western Blotting 检 测P53、Bcl-2、P21 蛋白表达水平

使用不同浓度含沙棘油培养基干预HGC-27 细胞，提取蛋白用Western Blotting 检测凋亡基因P53、Bcl-2、P21 蛋白表达量，结果如Fig.3 所示，较对照组当沙棘油浓度为10、20、40 μg·mL-1时，P53 蛋白表达量均明显增加，P<0.05 差异具有统计学意义；较对照组当沙棘油浓度为5、10、20、40 μg·mL-1时，Bcl-2 蛋白表达量均明显降低，P21 蛋白表达量均明显升高，P<0.05 差异具有统计学意义。

Fig.3 The protein expression level of P53,Bcl-2,P21 on HGC-27 cells intervented by seabuckthorn oil

3 讨论

近年来胃癌的发病率及死亡率呈现上升趋势，严重影响人类健康［7］。与胃癌相关的肿瘤基因成为抗肿瘤的研究热点，其中促进癌细胞凋亡的P53 基因起初被认为是一种致癌基因，随着研究的深入P53 抑癌功能逐渐被发现［8］。P53 通常在Bcl-2 家族的作用下通过线粒体调控凋亡，Bcl-2 家族主要由抑制细胞凋亡蛋白和促进细胞凋亡蛋白组成，P21 基因是人体最主要的凋亡基因，是极重要的促细胞凋亡基因之一［9-10］。研究发现P53 作为转录因子在转录水平激活P21 的表达，进而引起细胞衰老，抑制肿瘤的增殖、促进肿瘤细胞凋亡［11］。林方德等研究发现黄芩苷可通过上调人胃癌MGC-803 细胞p53 蛋白表达，下调抗凋亡蛋白Bcl-2 表达，有效促进细胞凋亡，抑制肿瘤进展［12］。

沙棘为胡颓子科酸刺属的落叶灌木或小乔木，又名沙枣、酸柳果、酸柳［13］。沙棘籽油是从沙棘种子中提取的油液，是一种宝贵的药用植物油，在抗肿瘤和增强免疫能力方面有独特的生理功能［14］。沙棘提取物及单体化合物对肿瘤活性有很好的抑制作用，沙棘提取物中富含有黄酮类化合物、白花青素、苦木素、香豆素等对抗癌作用功效显著［15］。据报道沙棘汁富含维生素C和E，沙棘中还含有大量的黄酮类物质，罗昕通过使用沙棘提取液对K562、HL-60、YAC-1 肿瘤细胞体外干预培养，受试药对HL-60、YAC-1 细胞DNA 合成有抑制作用，对K562 细胞DNA 中UdR 有释放作用，提示沙棘提取液对血液肿瘤细胞生长有明显抑制作用［16］。张哲民研究发现沙棘树皮提取物、沙棘树皮和树枝混合提取物具抗转移活性，沙棘树枝、叶、根提取物、树皮油、果和叶油对艾氏腹水癌未表现出抗肿瘤特性［17］。刘雪梅等研究发现使用沙棘油浸泡过的鼠粮喂养的小鼠，治疗组小鼠肿瘤的生长明显受到抑制，对照组小鼠肿瘤的生长情况相反，推断沙棘油阻碍肿瘤的生长［18］。朱煜研究发现沙棘油对脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡有一定抑制作用且其抑制casepase 通路中的线粒体途径是其可能的机制［19］。

本研究通过使用沙棘油干预胃癌HGC-27 细胞，通过CCK-8 实验测定细胞活性的变化，实验结果显示5、10、20、40 μg·mL-1的沙棘油能够有效抑制HGC-27 细胞的增殖。陆林发通过使用沙棘果渣总黄酮干预胃癌细胞，应用CCK-8 法检测不同浓度的沙棘总黄酮对胃癌细胞增殖能力的影响，结果显示不同浓度沙棘总黄酮能不同程度地抑制人胃癌细胞SGC7901 的增殖，并且呈剂量和时间依赖性，本研究与此结果趋势一致［20］。通过Western Blotting 检测凋亡基因P53、Bcl-2、P21 变化，结果显示10、20、40 μg·mL-1的沙棘油干预HGC-27 细胞，P53、P21 蛋白表达量较对照组明显增加，Bcl-2 蛋白表达量较对照组明显降低，提示胃癌细胞凋亡增加，本研究结果与朱煜研究趋势一致［19］。

综上所述，沙棘油可通过P53 信号通路促进胃癌HGC-27 细胞凋亡，抑制肿瘤增殖，来达到抗肿瘤作用，沙棘油具有良好的抗肿瘤作用。