应用选择性反应/多反应监测技术（SRM/MRM）对驱虫斑鸠菊黄酮成分的分析研究①

胡 雯，王红娟，康晓静

（新疆维吾尔自治区人民医院皮肤性病科；新疆皮肤病研究重点实验室（XJYS1707），乌鲁木齐 830001）

驱虫斑鸠菊[Vernoni a anth elmi nt ica(L.)willd]为菊科斑鸠菊属1年生草本植物，主要生长在新疆喀什、阿克苏等地区，是新疆特色药中最常用的增加色素药[1]。研究表明驱虫斑鸠菊的化学成分主要包括黄酮类、咖啡酰基奎宁酸类、倍半鞛类及挥发油等[2-3]，具有清热解毒、消炎、活血化瘀、杀虫祛斑等功效[4-5]，临床上主要用于白癜风、糖尿病、高血脂、抗肿瘤等的治疗[6]。驱虫斑鸠菊所含化学成分复杂，黄酮类是驱虫斑鸠菊的主要活性成分[7-8]，具有抗氧化、抗炎等多种功能[9-10]。本研究采用选择性反应/多反应监测技术（SRM/MRM），利用超高效液相色谱及MRM质谱分析法，对驱虫斑鸠菊种子类黄酮物质进行定量鉴定，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器8453型紫外可见分光光度仪（美国Agi⁃lent公司），FA-1004型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），5500 QTRAP型质谱仪（北京柏莱斯特科技发展有限公司），ACQUITY UPLC I-Class系统(沃特世科技（上海）有限公司)，BR4I型离心机（北京军洋科技有限公司），Eppendorf 5430R型低温高速离心机（上海妙生科贸有限公司），Waters色谱柱（沃特世科技（上海）有限公司，2.5µm,2.1 mm×150 mm）。

1.2 试药芦丁标准品（上海源叶生物科技有限公司），乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝（国药集团化学试剂有限公司），甲酸（美国Honeywell公司，批号94318），甲醇（美国Fisher Chemical公司，批号A452-4），乙腈（美国Sigma公司，批号34851-4L），异丙醇（Fisher Chemical，A461-4）、标准品购自Sigma-Al⁃drich和Steraloids公司。

1.3 药材驱虫斑鸠菊2020年1月购于新疆乌鲁木齐市埃力克维吾尔医药房，由新疆维吾尔自治区药物研究所艾塔尔主任药师鉴定为菊科植物驱虫斑鸠菊[Vernoni a anth elmi nt i ca(L．)Willd．]的干燥成熟种子。

1.4 驱虫斑鸠菊种子总黄酮含量测定

1.4.1 测试溶液的配制 称取适量粉碎后驱虫斑鸠菊种子粉末于具塞三角瓶中，加乙醇溶液（体积分数60%）50 mL，40℃超声提取50 min后，过滤，再加入40 mL乙醇溶液（体积分数60%）40℃超声提取20 min，过滤，合并滤液，用10 mL热乙醇溶液（体积分数60%）洗涤滤渣，滤液并于容量瓶中，冷却至室温，用乙醇溶液（体积分数60%）定容至刻度，摇匀，备用。

1.4.2 总黄酮含量测定 吸取2.0 mL测试溶液于25mL具塞比色管中，用乙醇溶液（体积分数60%）补充至5.0 mL，加入1 mL亚硝酸钠溶液（50 g/L）摇匀，放置6 min，加入1.5 mL硝酸铝溶液（100 g/L），摇匀，放置6 min，加入4 mL氢氧化钠溶液（200 g/L）用乙醇溶液（体积分数60%）定容至刻度，摇匀，放置15 min。用1 cm比色皿以相应的不添加硝酸铝溶液（100g/L）的试样液作为空白进行校正，在波长510 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，芦丁含量为横坐标计算回归方程为：Y=0.003 8X-0.001 8（r=0.999 8）。样品中总黄酮含量计算公式：X=[（m1×V）/（M×V1）]×100，式中X为样品中总黄酮含量（mg/100 g）；M为试样的质量（g）；m1为回归方程计算出试样溶液中总黄酮的质量（mg）；V1为测定时吸取试样的体积（mL）；V为试样的提取体积(mL)。

1.5 SRM/MRM技术定量驱虫斑鸠菊种子类黄酮物质

1.5.1 类黄酮物质提取 取“1.4.1”项下样品500µL于2 mL离心管中，4 000 r/min离心5 min,取上清液过Ostra96孔板，进样5µL进行液质联用分析。

1.5.2 高效液相色谱条件 Waters ACQUITY UPLC I-Class系统，自动进样器温度：4℃；流动相A和B分别为0.1%甲酸水-乙腈；梯度洗脱程序为：0～3 min B相由5%升至20%，3～4.3 min B相由20%至20%，4.3～9 min B相由20%升至45%，9～11 min B相由45%升至98%，11～13 min B相保持98%，13～13.1 min B相由98%降至5%，13.1～15 min B相保持5%，流速为：400µL/min；进样量：5µL。

1.5.3 质谱分析条件 Sciex 5500 QTRAP质谱仪，正负离子切换模式下进行MRM质谱分析。正离子模式离子源参数如下：Source temperature,550℃;Gas 1,55;Gas 2,50;CRU,30;ISVF,5 500 V；负离子模式离子源参数如下：Source temperature,550℃;Gas 1,55;Gas 2,50;CRU,30;ISVF,4 500 V。

1.6 KEGG数据库富集驱虫斑鸠菊种子黄酮类物质参与的相关生物合成过程KEGG compound数据库存储了在生命活动中发挥作用的各种小分子，生物大分子和其他类型的化学物质，包括有机酸,脂类，碳水化合物，核酸，肽链，维生素和辅助因子，类固醇，激素和递质，抗生素共9大类别。采用C number进行标识，用map+数字组ID表示物种通用通路ID，对于所有compound的分类详见Brite数据库：http://www.genome.jp/kegg-bin/get_htext?br08001.keg。

2 结果

2.1 驱虫斑鸠菊类黄酮物质定量结果驱虫斑鸠菊种子总黄酮类物质含量为0.97 g/100 g。各类黄酮化合物的色谱分离较好，峰形尖锐对称，相关系数均大于0.99，能够对各类黄酮化合物进行质谱定量，见图1。对驱虫斑鸠菊种子样品采用SRM/MRM技术，经高效液相色谱后进行MRM质谱分析，共获得36种类黄酮化合物，含量前5位的化合物为：圣草酚（1 2 650.98 ng/100 g）、异槲皮苷（7 293.86 ng/100 g）、木樨草素（4 503.38 ng/100 g）、紫铆素（4 320.83 ng/100 g）和柚皮素（3 390.59 ng/100 g）。异黄酮化合物芒柄花黄素和黄豆素含量较少，仅占1.07 ng/100 g和1.81 ng/100 g。保留时间最短的为(-)-表没食子儿茶素和儿茶素，分别为2.76 min和3.26 min。保留时间最长的为鹰嘴豆芽素A和葛根素，分别为10.65 min和10.81 min，驱虫斑鸠菊种子黄酮类物质定量结果见表1。

图1 黄酮类标准品混合物XIC图谱

2.2 驱虫斑鸠菊类黄酮各组分涉及主要分子生物学过程的KEGG富集分析驱虫斑鸠菊类黄酮各组分在KEGG数据库中参与的主要分子生物学过程见表2，主要包括类黄酮生物合成、黄酮和黄酮醇生物合成、异黄酮生物合成、泛醌和其它萜类生物合成及酪氨酸代谢等。

表2 驱虫斑鸠菊类黄酮各组分涉及相关通路的KEGG富集分析

3 讨论

本研究采用SRM/MRM技术，以标准品为参照，对特定代谢物群进行有针对性地、特异性地检测与分析，并可获得目标代谢物的绝对定量结果，具有特异性强、灵敏度高、准确性高的特点。SRM/MRM技术基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子对进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰。在定量分析过程中，该技术首先筛选目标代谢物特异性的母离子，然后选择性地对这些母离子进行碰撞诱导，去除其他离子的干扰，只对选定的MS/MS2离子进行质谱信号的采集，从而实现对目标代谢分子更为特异、灵敏、准确的分析[11-12]，该方法对成分复杂的中药研究具有重要的意义。

驱虫斑鸠菊化学成分的复杂多样性以及药理活性的广泛性，使其在抗肿瘤、抗感染、免疫学等方面都具有十分广阔的开发前景。目前，国内外对驱虫斑鸠菊主要集中在粗提物方面的研究，尤其是果实的氯仿、丙酮等溶剂提取物的药理活性研究，而对驱虫斑鸠菊化学成分的系统研究较少[13-14]。有文献报道[15]，从驱虫斑鸠菊果实中共鉴定出15种黄酮类成分，其中黄酮类成分紫铆素及紫铆查尔酮能够调控机体内黑色素合成和调节免疫系统功能，提示驱虫斑鸠菊药材中黄酮类成分可能是治疗白癜风的活性成分。王加利等[16]发现驱虫斑鸠菊乙醇提取物中30个黄酮类物质。本研究采用乙醇萃取法，测定驱虫斑鸠菊种子总黄酮类物质含量通过SRM/MRM技术，利用超高效液相色谱及MRM质谱分析，对驱虫斑鸠菊种子类黄酮物质进行定量鉴定，共获得36种类黄酮化合物，含量前5位的化合物为：圣草酚、异槲皮苷、木樨草素、紫铆素和黄烷类柚皮素。有研究报道通过抑制多巴胺诱导氧化应激相关JNK、p38 MAPK和Akt通路激活，从而有效减少黑素细胞内ROS产生，发挥抗氧化应激作用，保护黑素细胞[17]。本研究步结合KEGG信号通路，对驱虫斑鸠菊类黄酮成分涉及的相关通路进行初探，为进一步了解驱虫斑鸠菊类黄酮成分作用机制提供帮助。