基于DIA LC-MS对III期食管鳞癌和食管良性疾病患者外周血外泌体差异蛋白的研究①

阿尔孜古丽·吐尔逊，杨丽菲，郑树涛，，刘 清，，刘 涛，4，张琪琪，韩秀娟，卢晓梅，

（1新疆医科大学临床医学研究院，2新疆医科大学附属肿瘤医院肺内科一病区，3省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室,乌鲁木齐，830011;4新疆医科大学第一附属医院检验科,乌鲁木齐 830054）

食管癌（esophageal cancer，EC）仍是我国常见的消化系统恶性肿瘤[1]。食管癌组织学类型分为食管鳞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）和食管腺癌（adenocarcinoma of the esophagus，EADC），前者占我国所有食管癌患者的90%[2]。

由于食管癌起病隐匿，初诊时多数患者因处于中、晚期而失去手术治疗机会，因而五年生存率约为15%～25%[3]。外泌体是一类细胞自主释放、大小统一、直径在30～150 nm的微型小泡,研究发现外泌体在肿瘤转移的多阶段中均发挥重要作用[4]。因此，从外泌体层面了解ESCC发生发展机制进而指导临床治疗与干预有着重要现实意义。随着医学技术的迅猛发展，蛋白质组学已成为研究高通量复杂蛋白的主流工具。而采用数据非依赖性采集高分辨率色谱-质谱技术（data independent acquisition liquid chro⁃matography-mass spectrometry,DIA LC-MS）研究ES⁃CC患者外周血外泌体组学的研究较少，因此本研究采用DIA LC-MS技术分析ESCC患者及食管良性疾病患者外周血外泌体蛋白图谱，并通过生物信息学技术找出差异蛋白并进行分析，从而揭示食管癌发生发展的分子分型调控机制，为该病的早期诊断和后期治疗提供数据基础及策略。

1 材料与方法

1.1 研究对象本研究通过新疆医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准（K-2019054），标本的获取征得患者知情同意。用于外泌体蛋白质组学的分析样本包括3例III期ESCC患者和3例食管良性疾病患者，ESCC患者均为溃疡型，食管良性疾病患者均为食管平滑肌瘤患者，上述人群无糖尿病且均行手术治疗并通过手术后病理明确分期。

1.2 仪器与试剂超速离心机、EASY-nLCTM 1200 UHPL、Q ExactiveTM系列质谱仪（美国Thermo）；透射电镜（日本ZETA）；粒径分析仪（福建福流生物）。食管鳞癌细胞系KYSE150由中国医学科学院国家重点实验室馈赠；CD9、CD81抗体购自美国Proteintech公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌体的分离与纯化 抽取患者外周血4 mL，2 000 g离心10 min留取血浆。随后4℃条件下依次离心4 000 g×20 min、12 000 g×30 min，0.22µm滤器过滤留取血浆，后超速离心机100 000 g×60 min离心2次，最终将沉淀重悬于PBS中用于后续分析。

1.3.2 外泌体鉴定 透射电镜拍照：取外泌体样本5µL滴加在铜网上，室温孵育5 min后向铜网上滴加一滴2%的乙酸双氧铀，室温干燥20 min后上机观察。纳米微粒追踪（nanoparticle tracer analysis，NTA）检测粒径：PBS重悬外泌体稀释至合适的浓度后，样品上机检测颗粒的粒径分布。免疫印迹法（Western-blot，WB）检测CD9、CD81蛋白表达：RIPA裂解液裂解外泌体，后使用BCA定量试剂盒检测外泌体蛋白浓度，外泌体上样量为50µg，电泳时选择10%的分离胶和4%的浓缩胶制备聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳时浓缩胶以70 V电泳，约30 min后进入分离胶调整电压为100 V。采用湿转的方法转膜，100 V转膜120 min，室温封闭2 h后将膜置于1∶1 000的CD9、CD81的一抗稀释液中4℃摇床过夜，第二天TBST洗膜3次后山羊抗兔二抗孵育1 h后洗膜曝光显影。

1.3.3 质谱蛋白酶解 取蛋白样品120µg，加入蛋白溶解液补足体积至100µL，后加入胰酶（约1.5µg）和100 mM TEAB缓冲液（约500µL），充分混匀后于37℃酶切4 h。随后加入胰酶和CaCl2酶切过夜。然后调节pH小于3（使用甲酸），混匀后于室温、12 000 g离心5 min，取上清缓慢通过C18除盐柱，之后使用0.1%甲酸和3%乙腈配置的清洗液清洗3次，再加入适量0.1%甲酸和70%乙腈配置的洗脱液，收集滤液，冻干。

1.3.4 质谱方法 数据依赖式采集模式（Data inde⁃pendent acquisition，DDA）：将酶解后的多肽样本溶解在12µL的A液（0.1%甲酸的水,含0.4µL的i RT标准肽）中,然后在EASY-nLCTM-1200 UHPLC色谱系统上进样1µg。采用正离子扫描,范围为350～1 500 m/z。一级扫描模式为全扫描,一级检测轨道分辨率120 000（200 m/z），自动增益控制为3×106,最长注射离子时间为80 ms。二级检测轨道分辨率15 000（200 m/z），自动增益控制为5×104,最长注射离子时间为45 ms。DIA数据采集:一级扫描模式为全扫描,范围为350～1 500 m/z,一级检测轨道分辨率60 000（200 m/z），自动增益为1×106，最长注射离子时间为20 ms。使用高能碰撞方法碎裂行二级质谱检测，窗口为50个固定窗口,生成质谱原始数据。

1.3.5 差异蛋白生物信息学分析 采用软件Pro⁃teome Discoverer 2.2（PD2.2，Thermo）对DDA数据进行分析,将搜库结果导入软件Spectronaut（version 9.0，Biognosys）以此生成谱图库。随后进行数据分析与数据提取。将筛选分析出的差异蛋白使用inter⁃proscan软件作基因本体（gene ontology,GO）与京都基因与基因组百科全书（kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG）通路分析。将从蛋白质的生物过程、分子功能、细胞组分进行基因本体分析。

1.4 统计学处理实验所得数据采用SPSS 19.0软件处理，两组间比较采用独立样本t检验。当蛋白丰度（Fold change，FC）上调达到1.5倍以上或下调0.67倍以下,且经统计检验其值小于0.05时,视为差异蛋白。

2 结果

2.1 外泌体的鉴定透射电镜观察提取细胞外囊泡形状为圆形囊泡与双层膜结构；NTA分析显示的细胞外囊泡直径范围为30～150 nm；WB检测提示细胞外囊泡表达CD9、CD81。以上数据表明所分离出的ESCC患者外周血细胞外囊泡为外泌体（图1）。

2.2 III期ESCC患者与食管良性疾病患者外周血外泌体蛋白图谱特征通过DIA LC-MS的质谱定量技术，本研究对3例III期ESCC患者和3例食管良性疾病患者进行了蛋白图谱分析,结果表明上述6例患者外周血外泌体中共检测到1018个蛋白（图2）。基于蛋白质粗筛后的信息，以FC＞1.5及FC＜2/3和P＜0.05为诊断标准选择上调或下调的蛋白。最终，共筛选出21个差异蛋白，其中包括10个过度表达基因（红点）和11个下调基因（绿点）（图3）。

图1 c:外泌体蛋白WB显影图图1 ESCC来源外周血外泌体的鉴定

图2 蛋白质组学质谱鉴定到的蛋白质总数

图3 差异蛋白火山图

2.3 基于差异蛋白的生物学功能和通路分析针对以上21个具有显著性差异的蛋白,进一步做了富集分析,结果表明:细胞组分本体中主要涉及的细胞黏附和代谢,包括细胞黏附、细胞-细胞间黏附以及核苷酸代谢、磷酸戊糖代谢等过程。细胞组分本体中主要富集的是胞质成分。而对于分子功能本体而言,则涉及多个酶活性（比如2，3-环核苷酸-3磷酸酯、七磷酸七戊酮糖、肽酶活性等）（图4）。在对这些差异蛋白进行KEGG通路分析后显示：叶酸代谢通路、核糖体代谢通路、蛋白质生物合成、补体以及凝血等通路可能与食管鳞癌的发展密切相关（图5）。

图4 基于差异蛋白的GO功能分析

图5 基于差异蛋白的KEGG通路分析

3 讨论

外泌体由脂质双分子层包裹着大量的核酸物质,包括小RNA、信使RNA、piwiRNA、核糖体RNA、长非编码RNA、小核RNA、小核仁RNA以及线粒体DNA,它在细胞间通讯发挥重要作用[5-6]。本研究对食管良性疾病患者和III期ESCC患者外周血外泌体进行了提取、鉴定，提示成功提取外泌体，随后行蛋白质组学鉴定。本研究中共鉴定到1018种蛋白，依据FC上调达到1.5倍以上或下调0.67倍以下，共得到21种差异蛋白，通过对这些差异蛋白行GO分析提示细胞黏附和代谢参与食管癌的发生、发展。

本研究探索ESCC患者与食管良性疾病患者外周血外泌体蛋白质谱差异，这将有利于我们从外泌体功能层面研究ESCC的发生发展机制,以此发现相关生物标志物，从而为食管癌的早期诊断和后期疗效评价提供理论支持。

本研究中，鉴定到包括细胞黏性分子、蛋白修饰酶、结构蛋白等多种蛋白。与其他癌肿的外周血外泌体蛋白质谱研究相比[7-9],本研究鉴定出来的蛋白质种类广泛、数目多。首先我们选择了外泌体提取的经典方法-差速离心法。有研究发现差速离心法较商业化试剂盒提取外泌体纯度高[10]、鉴定蛋白质种类多。此外，我们选择了既高通量又定量精准重复性高的DIA法。对于传统蛋白质组学的研究主要采用DDA技术，然而该数据采集模式具有重复性差、定量不精准、数据缺失多、低丰度蛋白难以检测等固有缺点。因此在对成分复杂的蛋白质样本研究有一定的限制性。而DIA法则将所有质谱扫描范围分为若干窗口,且循环、高速地对每个窗口的所有母离子进行选择、碎裂、检测,无遗漏地获得样本中所有母离子信息。因而DIA法具有更高的蛋白覆盖度[10]。本研究鉴定蛋白数目多，这将对探寻食管癌外泌体功能有一定指导意义。

本研究对差异蛋白行GO功能分析与KEGG通路富集研究发现，细胞黏附、代谢通路的激活可能在食管鳞癌发生发展中发挥重要而关键作用。恶性肿瘤最主要的特点就是浸润与转移，而肿瘤转移是一个复杂过程，其中重要环节就是脱落的肿瘤细胞通过血液、淋巴液循环定植在远隔器官形成转移灶。多项研究表明外泌体是肿瘤生长的重要参与者[11-14]。本研究发现黏附相关蛋白在外泌体中富集丰度高，这将有利于深入了解外泌体介导肿瘤转移过程，同时将对肿瘤转移的早期发现提供理论支持。此外，本研究发现代谢相关通路的激活，尤其是叶酸代谢通路的异常在肿瘤发展中亦发挥重要作用，既往已有研究发现在不同分期食管癌患者血清中叶酸含量与临床分期存在关联性[15]，且基础研究亦发现叶酸代谢紊乱与食管鳞状上皮损伤相关[16]。代谢通路的异常改变有助于进一步了解肿瘤代谢及其对肿瘤转移的影响。

综上所述，本研究从人外周血中提取出外泌体且完成鉴定工作。通过对ESCC和食管良性疾病患者外泌体行蛋白质组学研究发现，细胞黏附和代谢异常可能是食管癌发生发展的重要过程。虽然本实验未对上述差异蛋白行大样本验证，但本研究将丰富对食管癌浸润转移的认识。