全基因组测序技术在口岸耐多药肺结核诊断中的应用探索

温 颖 吴 健 吴培丰 高颖龙 陈 平 谭家辉 何洪涛 王向阳 张建明（通讯作者）广州国际旅行卫生保健中心（广东，广州，510635）

赵 卫 谢 茜 赵久波 余健海 覃直然 南方医科大学公卫学院（广东，广州，510515）

耐药结核始终是结核病防控的焦点与难点［1］，尤其是耐多药结核（MDR-TB），其传播危害大、传染期长、治疗费用高（是普通肺结核的100倍）、治愈率低（约为50%），是影响结核病防控工作的最重要因素。2019年，全球近50万人患单利福平耐药结核（RR-TB），其中78%的人患MDR-TB［2］。若MDR-TB患者在口岸未能及时准确检出，造成跨境传播［3-4］而至暴发［5］，将对我国境内以及境外个人、家庭和国家造成严重的公共卫生负担。因此，我国口岸对传染性肺结核的诊断不应仅局限于临床病原体的鉴定水平，快速、准确且高通量的MDR-TB检测技术，将是未来口岸结核病防控的必要工具。目前经典的药物敏感性检测（DST）耗时长（2-4周），而市场上主流的线性探针技术（LPA）、Xpert等MDR-TB检测技术仅对目前已知的异烟肼（isoniazid，H）和/或利福平（rifampicin，R）的耐药经典位点进行检测，可能出现一定程度的漏检［6］，均不适宜未来口岸的防控需求。全基因组测序（WGS）技术可对结核菌株耐药突变位点检测全面覆盖，且具有准确、高通量等优点［6］。本研究应用WGS技术对2008-2018年广州国际旅行卫生保健中心结核生物样本库中的MDR-TB相关菌株进行检测，并综合患者流行病学及治疗情况，探索单末端（SE）50WGS-NDA纳米微球（DNB）技术在口岸MDR-PTB检测方面应用的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料收集

本研究收集整理2008-2018年广州国际旅行卫生保健中心结核生物样本库中的结核临床分离耐药菌株（HR、RR、MDR和XDR）92株，按照2∶1比例随机抽取库中敏感菌株46株。

1.2 实验方法

1.2.1 菌种复苏

138株结核生物样本库保藏菌株，取0.5mL接种于罗氏培养基，37℃孵育箱培养数周。挑取生长菌落进行抗酸染色（抗酸染色液，珠海贝索）及MPB64蛋白（结核分枝杆菌抗原检测试剂盒，杭州创新）快速初步鉴定。TB/NTM混合生长、液化或生长状态不佳菌株者弃之。待肉眼可见有良好菌落生长时，挑取适量菌落分别进行BD960液体比例法药敏试验和LPA分子药敏检测，进一步确认菌株的药敏检测结果。

1.2.2 药敏试验

1.2.2.1 BD960液体比例法 培养基中药物的最终浓度。一线药物：链霉素（Streptomycin，Sm）1.0μg/ml；异烟肼（isoniazid，H）0.1μg/ml；利福平（rifampicin，R）1.0μg/ml；乙胺丁醇（ethambutol，E）5.0μg/ml；丙嗪酰胺（pyrazinamide，PZA）5.0μg/ml。二线药物：氧氟沙星（ofloxacin，OFX）2.0μg/ml；阿米卡星（amikacin，AK）1.0μg/ml；卷曲霉素（capreomycin，CPM）2.5μg/ml；乙硫异烟胺（ethionamide，ETH）5.0μg/ml；对氨基水杨酸（paraaminosalicylicacid，PAS）4.0μg/ml。分枝杆菌培养、药敏试验培养管和BD960仪器由美国BD公司生产。

1.2.2.2 分子药敏检测法 采用热裂解法提取上述药敏试验对照管菌株DNA，进行LPA（gene type MTBDRplus试剂盒，HainLifescience公司）检测，对结核分枝杆菌复合群和异烟肼、利福平耐药实施分子鉴定和药敏检测，此法以下简称基因型药敏。DST表型药敏结果与LPA基因型药敏结果不一致的菌株实施重复2次的WGS检测。

1.2.2.3 结果确诊 经上述2种药敏方法确认，无法鉴定为结核分枝杆菌复合群（MTBC）或无法完成药敏试验，弃之；菌株耐药性若发生改变，以复苏后确认结果为准。

1.2.3 定义

采用BD960液体比例法对结核分枝杆菌菌株进行DST，仅对H耐药的结核菌株称为单耐异烟肼结核（HR-MTB）；仅对R耐药的结核菌株称为单耐利福平结核（RR-MTB）；同时对H和R耐药的结核菌株称为MDR-MTB；在MDR-MTB的基础上，再加上对氟喹诺酮类药物及二线注射类药物中任意一种药物耐药的结核菌株称为广泛耐药结核（XDRMTB）。

1.2.4 WGS检测

1.2.4.1 DNA提取

纳入研究的结核耐药和全敏感菌株，提取细菌基因组DNA（细菌DNA提取试剂盒，Magen），详见试剂盒说明书。采用0.8%琼脂糖凝胶电泳和Qubit分析仪对提取细菌基因组DNA进行质量控制。

1.2.4.2 DNB-WGS检测

采用华大智造MSP100文库制备仪和SEQ50基因测序仪进行SE50单末端测序，按照5ng起始量，以H37Rv（NC_018143.2）标准株作为耐药敏感株进行对照测序，采用Aglient2100对制备的文库进行质量控制，每株耐药结核菌至少同时重复测序2次。当每个测试Q30≧75%，total reads≧200M，SplitRate≧85%时，测序原始数据认为可用于下一步分析，SNP突变阈值线设定为90。

1.2.5 结果分析

使用Excel工作表收集DST表型和LPA分子药敏试验结果，对常见的耐药相关位点rpsL、katG、inhA、oxyR-ahpC、rpoB、embB、pncA、gyrA、gyrB、tlyA、rrs进行测序，采用抗生素综合检索数据库（CARD）进行耐药比对分析，所有表型全敏感菌株中均出现某一突变，或某突变占全敏感株≤10%，本研究将其表征为良性突变；耐药菌株若仅单出现上述突变位点，那么WGS分析结果时则将其予以剔除，但以上突变我们会将其作为导致耐药决定突变的潜在源进行进一步重复分析［6］；与耐药尚存有疑义的突变，本研究将其列入耐药分析。以BD960液体比例法DST结果为参考标准方法，比对LPA和WGS的耐药检测结果。

2 结果

2.1 纳入研究的MTB菌株的基本情况

92株耐药结核菌经复苏并验证药敏表型特性后，共有78株菌实施WGS检测。HR菌株28株，分离自28例患者，年龄范围为15-80岁，平均49.81±19.54岁，男性占71.43%（20/28），分别来自广东（19）、广西（5）、辽宁（1）、福建（1）、海南（1）和中国香港（1）。RR菌株14株，分离自3名患者，年龄范围为31-55岁，平均45.6±12.03岁，男性占2/3，均来自广东。MDR菌株35株，分离自29例患者，年龄范围为2-77岁，平均年龄42.59±21.34岁，男性占61.72%（15/29），分别来自广东（24）、贵州（5）、广西（1）、河 南（1）、辽 宁（1）、江 西（1）、吉 林（1）、天 津（1）。XDR菌株1株，自1例天津72岁退休女性晨痰中分离。全敏感菌株45株，均分离自临床PTB疑似患者晨痰，其中标准菌株H37Rv共重复检测6次（见表1）。

2.2 菌株LPA法检测结果

LPA法对78株耐药菌株进行分子药敏检测，未检出突变率为28.21%，LPA法检测45株全敏感菌株，除2株检出rpoB_H526D和rpoB_H526Y突变不纳入下一步检测外，其余检测结果与DST表型结果一致（见表1）。

表1 92株耐药结核菌株的基本情况

2.3 WGS制备文库质量控制

WGS每株菌株所制备的文库均对其扩增PCR片段进行质量控制，如14043号样本（LPA未检出突变，RR菌株）重复测序2次，制备的文库1和文库2的峰值均在180-300bp之间（见图1a，b），片段比较集中，与预期结果相符。产物浓度＞5ng/μL，可满足下一步DNB制备要求。

图1 14043号样本制备文库1和文库2的Aglient2100检测结果

2.4 43株全敏感菌株WGS检测结果

1株菌株检出NTM/MTB混合感染。标准菌株H37Rv未检出任意突变。71.43%（30/42）菌株同时检出gyrA_S95T和katG_R463L双突变。检出的良性突变有：gyrA_S95T，100%菌株均检出；thyA_T202A、embC_N394D、embC -T270I、embB_E378A、embC_V981L、embR_C110Y，9.52%（4/42）菌株检出；gyrA_E20Q、gyrA_G668D、gidB_E94D、embA_P913S、kas_G312S，7.14%（3/42）菌株检出；embC_R378Q、ndh_V18A和kasA_G269S，2.38%（1/42）菌株检出。

2.5 WGS与LPA检测结果比较

78株耐药结核菌株基因突变的LPA和WGS检测结果见表2。

表2 LPA与WGS检测耐药结核菌结果的比较

2.5.1 LPA已检出突变的56株菌株WGS检出了13株katG_S315T1、10株rpoB_S531L、25株rpoB_S531L、1株rpoB_D516V和25株katG_S315T突变；WGS未检出2株InhA_C15T突变 （但检出1株ahpC_M109L突变），2株rpoB_H526D和2株rpoB_H526Y突变。

2.5.2 LPA未检出突变的22株菌株

2.5.2.1 WGS检出了No.2、18和21为NTM/MTB混合感染。

2.5.2.2 WGS检出了No.10的KatG_S315T突变。

2.5.2.3 No.1，No.2-9和No.11-13共11株HR菌中，WGS均检出了gyrA_S95T（与突变是否相关存有疑义［7］）和katG_R463L（与HR相关存有疑义［7-9］）双突变，在No.5（来自海南1名30岁女性患者）和No.12（来自2008年WHO能力验证测试株）中分别检出了已有研究［10-11］证实的与HR相关的kas_G312S和katG_S315N突变，在No.12中还检出了与乙胺丁醇耐 药 相 关 的embB_E378A［12-13］，embB_D328Y［11］和embC_T270I［14-15］突变。

2.5.2.4 3株RR No.14-16菌株来自广东省一例53岁男性患者的初诊和治疗过程中复查的2次（疗程近3年）痰样，均检出gyrA_E21Q、katG_R463L、rpoB_V170F和gidB_E92D多突变，3株菌检测结果一致，为MDR-TB的可能性极大。

2.5.2.5 5株MDR No.18和21检测结果均为MTB/NTM混合感染。No.17、19和20均检出gyrA_S95T和katG_R463L双突变，No.20还检出RR相关rpoB_S450L、E耐药相embB_M306V［10］、S耐药相关rpsL_K43R和PZA耐药相关pncA_P54L等多突变，与表型耐药检测结果一致。

2.5.2.6 1株XDR No.22检出gyrA_S95T和katG_R463L双突变。

3 讨论

WGS技术应用于临床MDR-TB的诊断时代正在开启，但以往研究尚存在对于特定基因突变是否与耐药关联明确性不足的问题，因此该技术应用于临床的准确性和可行性仍有待进一步评估［15］。在临床测序检测的前中后整个过程中，如何进行菌株质量、测序文库和海量测序数据与临床表型耐药信息的有效对接分析等质量控制工作，以确保实验结果满足口岸临床检测快、准、稳的多项需求，是一项富有挑战性的工作。本研究以口岸十多年积累的结核生物样本库［16］菌株为材料，选取SE50 WGS技术为平台，运用全程质控理念，紧密结合患者临床资料进行综合分析，以期在以往大多以菌株本身作为研究对象进行的耐药突变位点的研究基础上，探索出一个适合口岸MDR-TB WGS的检测技术平台。

临床结核菌WGS检测结果的准确，首先在于严格控制临床分离菌株的菌体质量。本研究以生物样本库复苏的菌株作为模拟样本，从其生长状态、镜下形态学、免疫学方法鉴定、表型和分子药敏试验等多维度进行综合质量评估。NTM或其它杂菌污染可能导致WGS菌种鉴定和耐药分析的失败，因此在WGS检测前，检测技术人员应尽可能选取生长状态良好的纯菌进行检测，以确保后续检测结果的有效性和准确性。其次，为保证菌株药敏特性的可比性，本研究对每一株复苏菌株进行了严格的表型和分子药敏特征确认。我们发现HR和RR菌株中分别有7株（1/5）和1株（1/15）菌耐药特性由耐药转变为敏感，而MDR和XDR菌株的耐药性相对稳定，未发生变化。表型药敏比例法规定≥1%的分离株在临界药物浓度中生长则判为该菌株耐药，若排除人为操作原因导致的差异，HR和RR菌株耐药性发生变化可能是菌株本身即为耐药/敏感混合型菌株，在不同的检测中所取到的耐药/敏感菌比例不同所导致的检测结果不同。LPA分子药敏确认结果显示，其对H和R的耐药基因突变漏检率高达1/3（22/78），这与试剂盒本身设计有关，因此该法用于未来口岸耐多药结核检测并不是最佳选择。

结核病耐药机制非常复杂，目前较为公认的机制理论是MTB基因突变导致药物靶标发生变化，使药物无法结合变异的靶位。结核表型DST检测技术发展缓慢，操作人员技术要求高，操作流程复杂，某些情况下检测结果还有可能存在不可靠，因此快速精准的分子检测技术将成为未来的发展方向。鉴于商售分子检测技术存在的各种问题，WGS技术将为MDR-TB快速准确检测开辟一条新的道路，目前其主流有基于合成测序法的Hiseq、连接测序法的SOLiD和以联合探针锚定聚合技术（cPAS）及DNA纳米球（DNB）为核心技术的三大类测序平台。本研究选取国产平台的后者为基础，采用单末端50bp读长，测序深度为50X，进行结核单菌WGS检测，整体检测及分析时间（Turn around Time，TAT）约为30h，随着测序仪器性能和便携性的进一步提升，TAT可缩减至24h内，虽与目前商售分子药敏检测3-6h相比，还有更进一步的空间，但其具有高通量和突变检测覆盖全，可进行追踪传播链等［17］的优点，一旦耐药突变与临床患者真实情况可以准确对接并互译，那么其在未来结核病综合防控中将具有良好的应用前景。

WGS临床检测的成败和优劣，制备文库的质量，测序数据的步步有效筛选和WGS软件解读突变与临床菌株耐药结果的有效匹配性是整个检测的关键与难点。本研究发现影响文库制备的好与坏，主要在于酶切和建库方法的选择。我们对酶的组分和打断方式（体积、温度和时间）进行优化，建库方式选取仪器法，最终构建的文库稳定性和质量明显优于手工法。获取WGS下机数据后，本研究将首先对测序原始数据进行质量分析，soapnuke数据质量过滤后，与MTB标准菌株及NTM菌株参考序列进行序列比对进行菌种鉴定，再经过数据过滤、组装，进而与CARD耐药数据库比对，统计整理有意义耐药突变信息，最后基于文献报道及临床试验数据进行基因预测。

结核患者在治疗期间或出现耐药后，常发生NTM/MTB混合感染，这时实验室常常因为NTM与MTB性状相似导致难以分离出纯结核菌，致使DST表型和常规分子检测失败或结果不准确。本研究设定当结核单菌中混杂NTM量超过5%时，鉴定为MTB/NTM混合感染，本研究共检出4例NTM/MTB混合感染菌株，为临床医师确定后续治疗方案提供了更为全面的辅诊证据。目前本研究平台一旦鉴定出NTM/MTB混合感染菌株，则终止后续耐药分析，原因在于所获数据量不足以支持后续分析，今后我们将进一步优化检测与分析系统，在文库构建前将起始DNA的投入量增大20-40倍至100-200ng，以达到对目标菌耐药性进行有效分析的目的。

MDR-TB两种抗结核药物H和R，H是一种抗结核药物前体，需通过katG编码的触酶过氧化物酶活化产生游离的自由基，然后其攻击细胞内的多个药物靶点发挥药效。当katG基因（编码的触酶过氧化物酶是唯一能活化异烟肼前体的酶）发生点突变（突变频率为50%-80%）、碱基缺失或者插入时，触酶过氧化物酶活性下降或丧失，组织H变成活性形式，从而使MTB对H产生不同程度的耐药［18］。HR高水平耐药以katG_S315T突变为主，低水平耐药inhA突变（突变频率为15%-43%）为辅，inhA突变又以启动子区-15（C→T）突变为主［19］，控制解毒酶基因编码oxyR-ahpC基因的突变也会导致HR的发生，其突变频率为10%-15%。目前商售检测试剂突变位点的覆盖率总体为70%-90%，少有覆盖ahpC基因突变。抗结核药物R，通过与rpoB基因编码的细菌RNA聚合酶β-亚基结合，干扰、抑制细菌RNA的合成，抑制细菌的生长繁殖，导致细菌的死亡。rpoB基因的单个碱基突变或数个碱基联合突变或碱基的插入和缺失共30多种，突变常发生于在507-533位点间，以S511L、A516V、H526A、H526D、S531L突变为常见。

本研究构建的WGS SE50检测平台系统对结核耐药常见基因突变katG_S315T1、rpoB_S531L等均稳定检出。常规近七成LPA分子药敏无法检出突变的菌株中，我们在HR、MDR和XDR菌株中均同时检出了gyrA_S95T和KatG_R463L双突变，在3株LPA未检出突变的RR菌株中检出了KatG_R463L突变，虽然KatG_R463L突变是否为H的耐药决定性突变还存在争议，但gyrA_S95T和KatG_R463L双突变是否存在协同作用，KatG_R463L与其它突变以期致菌株成为MDRTB，有一定的可能性，我们需要后续更进一步的研究去证实。LPA法无法检出来自同一患者治疗前后的3株RR菌株，除检出KatG_R463L突变外，还检出了与氟喹诺酮类耐药相关的gyrA基因E21Q和G668D突变，与RR相关且常发生在北京株的rpoB_V170F［16］和与抗结核二线注射类药物相关的gidB_E92D突变，上述突变的存在可能与患者的难治性相关。对于LPA未检出突变的20号MDR菌株，WGS检出的突变可以很好地解释其表型耐药结果。对于LPA未检出突变的XDR菌株，WGS检出了gyrA_S95T和katG_R463L双突变，这进一步说明上述两突变对于结核耐多药及以上程度耐药的良好的预测作用。对于HR低水平耐药突变inhA_C15T和rpoB526位点突变，因尚未将其纳入分析范畴而致漏检，未来的研究中我们将在现有基础之上，不断完善耐药解读库，使之与临床匹配度不断增高。

2020年中国防新冠疫情最有效的措施便是隔离，如果未来口岸能通过WGS检测及时有效发现携带MDR-TB的旅行者，就有可能及时执行隔离措施，防止MDR-TB的扩散。