不同肠道微生物对果蝇交配行为的影响

魏博帆，王 露，李晓哲，李小辉，李苗苗，乔惠丽

(南阳师范学院 农业工程学院 河南省伏牛山昆虫生物学重点实验室，南阳 473061)

微生物在自然界中广泛存在，发挥着不可或缺的重要作用，大量微生物长期生存在动物体表或体内与宿主形成共生关系，并影响宿主的生长代谢和行为，尤其是肠道微生物与宿主之间的相互作用是最近国内外研究的热点。在昆虫中，肠道菌群的变化可直接影响宿主的取食[1-3]、发育[3-6]、产卵[2-3,7]和营养代谢[8-9]，在哺乳动物中，肠道微生物的变化甚至可导致疾病和癌症的发生[10]。

果蝇作为重要的模式生物之一，其肠道微生物种类相对简单，且肠道微生物可通过垂直转移从亲代果蝇转移到子代体内，因此果蝇是研究肠道微生物与宿主互作关系的理想材料。研究表明，作为果蝇肠道中的主要微生物之一，植物乳杆菌可通过调控TOR和生长激素信号通路促进果蝇的生长发育[11-13]。Becher等[14]发现酵母菌的代谢产物是吸引果蝇在成熟水果表面产卵的主要因素。Keesey等[15]发现在果蝇粪便中存在果蝇性信息素成分，而果蝇在水果表面留下的粪便可吸引其他果蝇的觅食和聚集。Sharon等[16]发现果蝇肠道共生菌植物乳杆菌在其交配偏好中发挥关键作用，可诱导果蝇更偏好选择与其肠道微生物组成相似的同伴进行交配。Morimoto等[17]研究表明，肠道微生物对果蝇的交配和繁殖不仅具有直接影响，同时还有一定的跨代影响。但关于肠道微生物对果蝇交配行为的影响和调控机制的研究还很有限。

由于果蝇肠道微生物菌群易受外界寄生环境中微生物的不同而改变，不同种类果蝇的地域分布不同，其肠道微生物的优势菌群也有所不同，可能在果蝇种间的生殖隔离中发挥作用[18-19]。目前发现野生果蝇的肠道微生物约有50种，而实验室饲养果蝇的肠道微生物仅十几种，主要为乳酸杆菌属和醋酸杆菌属微生物，这些肠道共生菌可在宿主外进行培养[19-22]。研究首先通过建立无菌果蝇体系，选取具有代表性的黑腹果蝇肠道微生物植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和醋酸杆菌(Acetobacteriummalorum)及果蝇培养基中添加的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，进行体外培养，分别对无菌果蝇和正常果蝇接种特定微生物，利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测接种后对应微生物在无菌果蝇和正常果蝇体内的富集情况，并检测不同肠道微生物对无菌果蝇和正常果蝇交配行为的影响，从而为肠道微生物与果蝇的互作研究提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和昆虫

实验所用微生物菌株植物乳杆菌(L.plantarum，20174)、醋酸杆菌(A.malorum，14337)和酿酒酵母(S.cerevisiae，1333)购自DSMZ德国微生物菌种保藏中心。L.plantarum和A.malorum用MRS肉汤培养基，S.cerevisiae用YPD培养基于30 ℃、200 r/min摇床培养，固体培养基中加入1.5%的琼脂。

实验所用的果蝇品系为野生型黑腹果蝇，培养条件为25 ℃，相对湿度为70%，光周期为12L∶ 12D。果蝇培养基的成分为(1 L)：红糖118 g，啤酒酵母粉22 g，玉米粉95 g，琼脂4.2 g，丙酸2.4 mL，30%对羟基甲酸甲酯3.3 mL。无菌果蝇培养基需将配好的正常培养基进行灭菌处理后，再加入丙酸和30%对羟基甲酸甲酯。用于果蝇卵收集的葡萄汁固体培养基的成分为(100 mL)：葡萄汁100 mL，乙酸1 mL，乙醇1 mL，琼脂糖1 g。收集果蝇卵时需在平板上涂抹适量的酵母膏。

1.2 试剂和仪器

MRS、YPD和LB培养基购自Solarbio公司，对羟基甲酸甲酯、次氯酸钠和丙酸购自天津化学试剂厂，RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自Thermofisher公司，实时荧光定量PCR试剂购自Roche。紫外分光光度计为德国Eppendorf，恒温培养箱和恒温摇床为上海智诚，超微量核酸蛋白浓度测定仪为Nanodrop2000。

1.3 无菌果蝇体系的建立

1.3.1 无菌果蝇体系

收集新羽化的果蝇，将其转移至用于收集果蝇卵的产卵装置中，该装置为100 mL的塑料烧杯，底部挖洞并用尼龙网密封以保证透气性，用涂有酵母膏的葡萄汁固体培养基平板盖住杯口，倒置于果蝇培养箱中，2 d后更换新的带有酵母膏的葡萄汁平板，收集产下后6 h以内的果蝇卵。将收集的果蝇卵于超净工作台中进行表面消毒处理，步骤依次：无菌水清洗卵表面3次，每次1 min；4%的次氯酸钠溶液消毒处理5 min，75%的乙醇清洗2次，每次2 min；无菌水清洗3次，每次2 min，处理好的卵用无菌滤纸吸去多余水分后转移至无菌培养基中培养[23-24]。

1.3.2 无菌果蝇体系的验证

无菌培养果蝇羽化后，取10只果蝇解剖肠道，加适量无菌水充分研磨，将研磨液分别涂于YPD、MRS和LB固体培养基平板上，30 ℃恒温培养，48 h后观察培养基上的菌落生长情况，若无菌落生长则成功获得无菌果蝇，如有菌落则说明消毒不彻底，丢弃并重新收集和处理新的果蝇卵。

1.4 正常及无菌果蝇的微生物接种及鉴定

1.4.1 果蝇肠道微生物的培养和接种

S.cerevisiae接种于YPD液体培养基，L.plantarum和A.malorum接种于MRS液体培养基，30 ℃摇床200 r/min培养24 h，按照1 mL OD600=1新鲜菌液(L.plantarum和A.malorum约108个细胞，S.cerevisiae约106个细胞)离心洗涤后，重悬于100 μL PBS的制备菌液样品，然后中号培养瓶每瓶100 μL菌液，小号培养瓶每瓶50 μL菌液，加入到果蝇培养瓶中，并使菌液均匀铺满培养基表面。取新羽化的无菌果蝇或正常果蝇成虫各30头，分别置于接种有微生物的果蝇培养瓶中，每12 h更换1次接菌培养基，2 d后收集果蝇检测[3]。

1.4.2 接种果蝇的鉴定

为了进一步检测不同果蝇肠道中活体微生物的丰度变化，不同于传统提取DNA做模板扩增微生物的rRNA，我们解剖果蝇肠道，液氮研磨，Trizol试剂提取果蝇肠道总RNA，RevertAid反转录试剂盒合成cDNA作为模板，以宿主果蝇rp49为内参基因，qRT-PCR检测3种微生物在不同果蝇肠道中丰度，并比较不同方法对果蝇接种微生物后肠道中相应微生物的丰度变化[12,25]。PCR反应体系如下：cDNA模板1 μL，正向引物/反向引物(10 μmol/L)各0.3 μL，PCR通用型预混液3.4 μL，加ddH2O至10 μL。扩增条件：95 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。每个样品3个重复。L.plantarum和A.malorum的16S rRNA，S.cerevisiae的18S rRNA及果蝇rp49的特异引物见表1。

1.5 果蝇的交配实验

选取新羽化的未交配的雌雄果蝇，未交配雄蝇每只单独于正常或接种特定微生物的小号培养瓶中饲养，未交配雌蝇30只于正常或接种特定微生物的中号培养瓶中饲养，每12 h更换1次培养基，4～5日龄的果蝇用于单对交配实验。果蝇单对交配实验在一个高0.5 cm，半径为1 cm，带透明盖的圆形交配装置中进行。观察果蝇的交配行为，记录雌雄果蝇成功交配所需的时间(交配潜伏期)及30 min内果蝇的交配成功率，每组10个重复。

1.6 数据分析

Prism5.0软件用于绘图和数据分析。qRT-PCR扩增结果采用2-ΔΔCt计算方法进行基因相对表达量分析(ΔCt=Ct样品-Ct内参；ΔΔCt=ΔCt样品-ΔCt对照)。

2 结果与分析

2.1 无菌果蝇体系的建立

将新羽化的无菌果蝇和正常果蝇解剖肠道，研磨后平板培养，比较无菌果蝇与正常果蝇的肠道匀浆后在相应培养基上的生长情况。结果(图1)显示，平板培养48 h后，正常果蝇的肠道匀浆物在3种不同培养基上都长出大量菌落，而无菌果蝇的肠道匀浆物，在3种不同培养基上都未长出任何菌落，由此表明，无菌果蝇体系构建成功。

(a)YPD平板；(b)MRS平板；(c)LB平板

2.2 果蝇肠道中特定微生物的分子检测

将正常果蝇和无菌果蝇分别在接种有S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的培养基中进行培养。通过qRT-PCR分别检测3种微生物在接种前后正常果蝇和无菌果蝇肠道中的丰度变化。无菌果蝇接种前后的检测结果(图2)显示，S.cerevisiae只在接种了该微生物的果蝇中大量存在，而在对照果蝇、接种L.plantarum和A.malorum的果蝇中几乎不存在[图3(a)]，L.plantarum和A.malorum也仅在接种了该微生物的果蝇中检测到大量存在，而在对照果蝇及接种其他2种微生物的果蝇肠道中几乎不存在[图 3(b)和(c)]。由此表明，通过在无菌果蝇培养基中添加特定微生物并对无菌果蝇进行培养可以成功获得该微生物的悉生果蝇。

1：无菌果蝇；2：接种S. cerevisiae的果蝇；3：接种L. plantarum的果蝇；4：接种A. malorum的果蝇

正常果蝇接种前后的检测结果如图3所示。S.cerevisiae、L.plantarum和A.malorum在正常果蝇肠道以较低水平存在，接种后的结果与无菌果蝇的结果类似，3种微生物都在接种了特定微生物的正常果蝇中大量存在，而接种其他两种微生物的正常果蝇肠道中不表达或极少量表达。由此表明，通过相同的方法对正常果蝇进行培养，同样可以达到特定微生物在果蝇肠道中大量富集的效果。

1：正常果蝇；2：接种S. cerevisiae的果蝇；3：接种L. plantarum的果蝇；4：接种A. malorum的果蝇

2.3 肠道微生物对无菌果蝇和正常果蝇交配行为的影响

将无菌未交配的雌雄果蝇、接种S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的未交配的雌雄果蝇分别进行单对交配实验。结果显示：4组果蝇在30 min内的交配成功率均为100%，但是接种了L.plantarum的雌雄果蝇的交配潜伏期显著高于其他3组果蝇，而其他3组果蝇的交配潜伏期无差异[图4(a)]。同时，正常果蝇及接种了S.cerevisiae、L.plantarum或A.malorum的正常果蝇的交配实验结果与无菌果蝇的结果一致，4组果蝇在30 min内的交配成功率均为100%，而接种L.plantarum的雌雄果蝇交配潜伏期显著高于其他3组果蝇[图4(b)]。由此表明，果蝇肠道微生物L.plantarum可以通过延长交配潜伏期影响果蝇成功交配前的相互识别，且在无菌果蝇和正常果蝇中的结果一致。

1：对照果蝇；2：接种S. cerevisiae 的果蝇；3：接种L. plantarum的果蝇；4：接种A. malorum的果蝇

3 讨论与结论

本研究利用传统方法成功建立了无菌果蝇模型，并通过接种植物乳杆菌L.plantarum、醋酸杆菌A.malorum或酿酒酵母S.cerevisiae获得特定微生物的悉生果蝇。同时为了模拟自然界中黑腹果蝇取食过程中摄入的微生物对其肠道微生物菌群及行为的影响，采用相同的方法对正常果蝇进行特定微生物的接种，从而使L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae在正常果蝇肠道中大量富集，进而改变正常果蝇肠道微生物的菌群比例。已有研究表明，利用qRT-PCR以宿主管家基因作为内参比较分析肠道微生物16S rRNA的表达量，其结果与16S rRNA的测序结果一致[25]。同时提取细菌的RNA，反转录后对其16S rRNA进行检测，其结果不仅与活菌培养菌落计数的结果一致，还可避免样品中死亡细菌的干扰[26-27]。本研究的qRT-PCR结果表明，接种L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae后正常果蝇肠道内该活体微生物的丰度远远高于其他微生物，从而达到了改变正常果蝇肠道内微生物菌群比例的效果。进一步通过观察接种L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae前后无菌果蝇和正常果蝇的单对交配情况，发现无论是正常果蝇还是无菌果蝇，与对照及接种A.malorum或S.cerevisiae的果蝇相比，在接种L.plantarum后果蝇的交配潜伏期显著升高，但对果蝇的交配成功率没有显著影响，由此表明单一植物乳杆菌L.plantarum可影响黑腹果蝇的交配前的相互识别。已知在动物中，肠道微生物可影响或改变宿主体表挥发性化合物的分泌[28-29]。在果蝇中，Keesey等[30]发现病原菌感染果蝇后可改变果蝇体表聚集信息素的分泌，感染病原菌的果蝇释放的信息素化合物急剧增加，从而吸引果蝇交配，同时感染更多果蝇以利于病菌的扩散。研究发现接种L.plantarum后果蝇的交配潜伏期延长，初步推测L.plantarum可能影响果蝇体表性信息素化合物的分泌，从而影响果蝇交配前期的相互识别。此外，研究发现，果蝇的行为不仅是受单一微生物的直接影响，肠道微生物与微生物之间还可通过相互作用，进而产生新的代谢产物来影响果蝇的行为[31]。由此可见，肠道微生物对果蝇行为的调控方式复杂多样，在自然界中，果蝇在环境取食中摄入的微生物可改变其肠道微生物的菌群，进而影响其交配行为，从而在不同果蝇的种间生殖隔离或物种进化中发挥作用。然而，肠道微生物影响果蝇交配行为的机制目前还不清楚，肠道微生物通过改变果蝇的哪种性信息素成分进而延长果蝇的交配潜伏期，还有待进一步深入研究。

研究成功构建了无菌果蝇体系，并获得了L.plantarum、A.malorum或S.cerevisiae的悉生果蝇；同时对正常果蝇接种3种微生物，也使特定微生物在正常果蝇肠道中成功富集；而且植物乳杆菌L.plantarum作为果蝇重要的肠道细菌，不仅可影响果蝇的交配偏好，还可通过延长交配潜伏期影响果蝇交配前的相互识别。该研究结果为后续果蝇肠道微生物与宿主之间的研究提供了新的思路；同时肠道微生物可以影响宿主的交配行为也为利用昆虫共生菌进行病虫害防控提供了依据。