可溶性B淋巴细胞刺激因子原核表达及其单克隆抗体制备

刘 冲，郜赵伟，王会平，和 婷，刘 丽，董 轲

(空军军医大学 第二附属医院 检验科, 西安 710038)

B淋巴细胞刺激因子(BLyS，又称BAFF、TALL-1)是肿瘤坏死因子配体家族中的成员[1-2]，主要表达于单核细胞、巨噬细胞和活化的T细胞[3]。人BLyS全长285个氨基酸，为Ⅱ型跨膜蛋白，有膜结合型和可溶性两种形式存在，二者生物学活性基本一致。膜结合型BLyS在蛋白酶作用下水解第132或133位氨基酸，产生由152个氨基酸组成的可溶性活性多肽，释放入血即为可溶性BLyS—sBLyS[4]。作为B淋巴细胞的共刺激因子，BLyS通过与B淋巴细胞表面受体结合而诱导其增殖、分化和免疫球蛋白产生，在体液免疫中发挥重要作用[5-6]。研究显示，BLyS可能在自身免疫病的发生发展中发挥重要的作用[7-11]。研究通过构建sBLyS-pRSETC原核表达载体，诱导纯化获得人sBLyS重组蛋白，并通过重组抗原免疫得到sBLyS的单克隆抗体，为后续sBLyS检测和临床研究奠定基础。

1 材料及方法

1.1 材料

pRSETC质粒、大肠杆菌JM109、BL21(DE3)为本实验室保存。外周血单个核细胞分离液购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；RNAiso Plus，cDNA反转录试剂盒，2×Taq酶、限制性内切酶(BamH I，EcoR I)、T4DNA连接酶，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)均购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，DNA胶回收试剂盒购自OMEGA公司；弗式完全佐剂和弗式不完全佐剂，HAT选择性培养基购自Sigma公司；PEG1500购自Roche公司；BALB/c小鼠购自空军军医大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 原核表达质粒pRSETC-sBLyS的构建

取2 mL抗凝血与2 mL生理盐水混匀，将稀释后的血液加至分离液液面，800 r/min离心30 min，取第二层乳白色细胞层，10 mL PBS洗2次。加入1 mL RNAiso Plus混匀，提取总RNA，利用TakaRa逆转录试剂盒制备cDNA。设计sBLyS引物，引物序列上游5′-CAGGATCCGAGCCGTTCAGGGTCCAGAAG-3′，下游5′-GCGAATTCTTACAGCAG TTTCAATGCACC-3′，PCR扩增获得sBLyS片段。将扩增片段与pRSETC载体连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒。酶切鉴定并送测序，将测序正确的质粒转入BL21(DE3)感受态，筛选阳性克隆。

1.2.2 重组人sBLyS蛋白表达

挑取BL21(pRSETC-sBLyS)菌落接种到5 mL LB中培养过夜，按1∶ 50接种到新鲜LB培养液中。培养至OD600为0.6，0.2 mmol/L IPTG诱导表达。5 000 r/min离心10 min收集菌体，加入2 mL PBS，冰浴条件下超声破碎，14 000 r/min离心10 min分别收集上清液和沉淀。SDS-PAGE检测蛋白表达。

1.2.3 重组人sBLyS蛋白纯化及鉴定

将获得菌液沉淀用8 mol/L尿素溶解并与镍柱结合，PBS洗涤3次，利用不同浓度(50、100和200 mmol/L咪唑)的Elution buffer分别洗脱收集目的蛋白，进行SDS-PAGE鉴定。将含目的蛋白的洗脱组分对去离子水透析过夜。收集蛋白进行SDS-PAGE，通过半干转将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，5%的脱脂奶粉室温封闭2 h，与商品化的BLyS抗体(1∶ 600稀释)杂交，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次，每次15 min。取出纤维素膜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶ 5 000稀释)，室温孵育2 h，TBST洗涤后使用ECL发光液进行显色。

1.2.4 sBLyS单克隆抗体制备

纯化的目的蛋白与弗式完全佐剂按照等体积混合后充分乳化。BALB/c小鼠(6～8周)皮下多点注射重组蛋白50 μg/只。4周后取小鼠血清进行抗体效价检测，选择抗体效价高的个体继续进行加强免疫，每4周免疫1次，连续进行3次免疫，第3次加强免疫不加佐剂腹腔注射抗原50 μg/只。3 d后取脾细胞与SP2/0细胞融合，培养10～14 d后选择体积较大的克隆进行ELISA筛选，将分泌sBLyS抗体的杂交瘤通过有限稀释法进行3～4次克隆化培养，直至所有单克隆均为阳性。BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油500 μL/只，两周后腹腔注射sBLyS阳性杂交瘤细胞1×106细胞/只，一周后抽取腹水。3 000 r/min离心5 min，收集上清液。

1.2.5 抗sBLyS单克隆抗体纯化及鉴定

腹水上清液15 000 r/min离心30 min，收集上清液，缓慢加入3倍体积的醋酸盐缓冲液，向上述溶液中逐滴加入1/40腹水体积的正辛酸，搅拌混匀10 min,10 000 r/min离心20 min,弃沉淀，测量上清液体积并加入等体积的饱和硫酸铵，将溶液轻轻混合2 h，10 000 r/min离心30 min，收集沉淀并溶于10 mL PBS中，对PBS透析24 h(4 ℃)，10 000 r/min离心10 min，收集上清液，SDS-PAGE检测抗体纯度，Western Blot检测抗体特异性。

1.2.6 单克隆抗体效价检测

将重组抗原sBLyS以25 ng/孔包被于酶标板中，以实验室保存原核表达B7H4蛋白作为阴性对照，纯化抗体倍比稀释后[分别为1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.2、15.6、7.8和0.0 ng/mL(空白对照)]间接ELISA法检测抗体效价，酶标仪检测A450值，[(纯化抗体A450-空白对照A450)/阴性对照A450]≥2.1为阳性，阳性抗体最低浓度即为效价。

1.2.7 HRP标记单克隆抗体及双抗夹心配对实验

取10 mg待标记抗体对pH 9.4碳酸盐缓冲液透析(Na2CO31.59 g/L，NaHCO32.93 g/L)4 h，取0.8 mL的高碘酸钠(25.6 mg/mL)与1 mL HRP(20 mg/mL)混匀放置30 min，加入160 μL的10%乙二醇，室温避光放置30 min，加入待标记抗体，透析过夜，加入320 μL硼氢化钠(5 mg/mL)混匀，避光放置2 h，加入等体积饱和硫酸铵，避光放置2 h，5 000 r/min离心30 min，弃上清液，加入2 mL的PBS溶解沉淀，对PBS透析过夜。将标记抗体作为检测抗体与未标记抗体两两配对组合进行ELISA双抗体夹心实验，筛选包被抗体与检测抗体的最佳组合。

2 结果与分析

2.1 原核表达质粒鉴定

利用特异性引物PCR扩增获得sBLyS基因片段[图1(a)]，双酶切鉴定表达质粒pRSETC-sBLyS后电泳得到456 bp目的片段和2 895 bp的载体片段[(图1(b)]，确定将测序正确的sBLyS插入pRSETC载体，说明表达质粒构建成功。

(a)The amplified sBLyS gene;(b)Enzyme digestion identification of sBLyS gene and pRSETC vector expression plasmid

2.2 重组人sBLyS蛋白表达、纯化及鉴定

诱导表达的菌体经超声破碎后离心分离上清液和沉淀，SDS-PAGE结果显示[图2(a)]sBLyS蛋白以包涵体形式表达，大小为20 ku，利用镍柱纯化蛋白，Image lab(Bio-rad)软件分析显示[图2(b)]纯化后蛋白纯度达到90%。将纯化后蛋白进行电泳，转印到硝酸纤维素膜上，与商业化的BLyS抗体杂交，结果显示[图2(c)]在20 ku处出现特异性条带，表明纯化后的sBLyS蛋白具有免疫活性。

(a)Expression of sBLyS[1: BL21 supernatant; 2: BL21 bacterial solution precipitation; 3: BL21(pRSETC)bacterial solution supernatant; 4: BL21(pRSETC)bacterial solution precipitation; 5: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution supernatant; 6: BL21(pRSETC+sBLyS)bacterial solution precipitation];(b)Purified sBLyS protein;(c)Western Blot detection recombinant sBLyS protein[1: BL21(pRSETC)bacterial protein; 2: sBLyS purified protein]

2.3 重组人sBLyS单克隆抗体的鉴定

获得4株sBLyS单克隆抗体(2E4、2H8、4C5和4C12)，将纯化后的抗体进行SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色结果显示纯度较高(图3)。Western Blot检测结果显示(图4)，单克隆抗体2E4、2H8、4C5和4C12具有sBLyS蛋白结合活性。

图3 sBLyS单克隆抗体纯化

图4 sBLyS单克隆抗体蛋白免疫印迹检测

2.4 单克隆抗体效价测定

间接ELISA法检测纯化抗体2H8、4C5、4C12和2E4的效价分别为10.8、20.4、26.6和9.6 ng/mL，抗体与B7H4蛋白不发生交叉反应，具有较好的特异性(图5)。

图5 4株抗人sBLyS单克隆抗体的效价测定

2.5 单克隆抗体配对筛选

4株抗体两两配对的双抗夹心ELISA检测显示，使用2H8作为捕获抗体包被酶标板，HRP-4C5作为检测抗体，具有较高的检测灵敏度，检测抗原的线性度范围为0.4～1.6 ng/mL(R2=0.995)，见图6。

图6 sBLyS/2H8和sBLyS/4C5-HRP检测sBLyS标准曲线

3 讨论与结论

BLyS是肿瘤坏死因子(TNF)家族成员，对B细胞的增殖、分化和存活具有重要调节作用[12]。sBLyS是BLyS的可溶性形式，具有BLyS的生物学功能[13]。研究显示，sBLyS在临床上具有两方面的作用：sBLyS检测可用于SLE的诊断和病情监测；sBLyS是SLE的治疗靶点。2011年，BLyS单克隆抗体药物(belimumab，贝利木单抗)获FDA批准，成为过去50多年来治疗SLE的首个抗体类新药。因此，制备抗sBLyS抗体对sBLyS诊断试剂和治疗药物开发均具有重要价值。

目前已有多个研究采用不同形式的制备方法筛选了靶向sBLyS的抗体，如徐海燕等[14]以稳定高表达BLyS的基因转染细胞L-BLyS为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠，获得1株持续、稳定分泌鼠抗人BLyS单克隆抗体的杂交瘤细胞株；鲁战平[15]运用计算机模拟技术设计抗BLyS单链抗体的基因序列(VHL和MHL)，利用重叠PCR等方法构建重组质粒，借助原核表达系统获得一株可以BLyS特异性结合的VHL蛋白序列。钱尼良等[16]利用抗原抗体特异性结合，通过依次降低抗原浓度从人源单链抗体库中筛选抗B细胞刺激因子的单链抗体基因、构建表达载体并表达获得一株BLyS单链抗体。然而目前仍无可应用于临床诊断的sBLyS检测试剂盒。

本研究利用原核表达方式获得高纯度的sBLyS蛋白，通过蛋白免疫和细胞融合技术获得4株高特异性的单克隆抗体，经双抗体夹心法ELISA实验，筛选出可用于sBLyS检测的抗体组合：2H8和HRP-4C5，为sBLyS检测试剂盒开发奠定了基础，同时为后续用于临床治疗试验的人源化抗体药物开发提供基础。