固相支撑液液萃取- 超高液相色谱- 串联质谱法测定全血中啶虫脒、吡虫啉、杀虫脒残留量

2021-06-23方雅莉

科学技术创新 2021年18期

方雅莉

（广东医科大学科研服务管理中心，广东东莞523808）

新烟碱类杀虫剂是一类高效的杀虫剂，目前在世界上应用广泛[1]。它的独特优势在于其具备一定的选择性，杀虫高效避免了很多害虫对氨基甲酸酯等传统类别的杀虫剂所产生的抗药性，因此被广泛使用于瓜果蔬菜等粮食作物的除虫。人们一度认为新烟碱类杀虫剂对哺乳类动物风险较低，是因为它与哺乳动物的乙酰胆碱受体的亲和力低。但经过研究表明，新烟碱类杀虫剂对哺乳动物不像当初设计的那么安全。由于此类杀虫剂在瓜果蔬菜等农作物中大范围使用，使得其在水体和土壤中的积累量逐年增加，通过膳食和饮水摄入成为人群暴露于新型烟碱类杀虫剂的主要途径。由于大范围的使用已对人群造成潜在的风险。据研究表明，吡虫啉和啶虫脒是样品中检出率最高的新烟碱类杀虫剂，中华人民共和国农业部第199 号公告明确禁止使用杀虫脒这一类高毒杀虫剂[2]。生态流行病学调查显示, 长期接触杀虫脒的工人膀胱癌发生率是普通工人的72 倍[3]，并在他们的尿中检出了代谢产物4-氯邻甲苯胺。同样，据研究显示，吡虫啉能够延缓部分动物胚胎的发育[4,5]，啶虫脒能够明显降低鸟类的精子密度[6]。因此，建立一种快速高效的对血液中的啶虫脒、吡虫啉、杀虫脒残留量检测方法很有必要，目前，应用最广泛的样品前处理方法是固相萃取[7-13]与液液萃取[14-18]。固相萃取重现性好且萃取柱价格适宜，一般较受青睐，但是上样前要将萃取柱活化、平衡及清洗，使的样品前处理步骤变得复杂，费时耗力，样品量少时可以使用。液液萃取利用目标物在两相中溶解度不同，来达到有效分离的目的，常用的有机溶剂有乙酸乙酯、二氯甲烷等，但是液液萃取需要的溶剂多，萃取过程中需要不断的充分振荡、离心，操作复杂，且液液萃取容易发生乳化现象，导致重现性差。综上可知，固相萃取和液液萃取两种前处理方法都无法满足流行病学调查中大量样本处理的需求。因此，急需一种简单易行的前处理方法来检验全血中的啶虫脒、吡虫啉、杀虫脒。固相支撑液液萃取柱的填料为惰性处理的硅藻土，具有疏松多孔的特点，加之表面活性低，比表面积高，相比传统的液液萃取方法，能够提供更大的液液分配支撑界面。传统液液萃取方法容易发生乳化现象，导致回收率偏低，除杂效果差，容易发生交叉污染，固相支撑液液萃取方法能够有效避免传统液液萃取的不足，操作过程仅需上样、静置、洗脱三步，省去了振荡、离心，取上层溶液等操作，整个过程不形成乳浊液，是生物、食品和环境样品的理想选择。相较于液液萃取、固相萃取等传统的样品前处理方法，固相支撑液液萃取能有效提高样品中目标物的提取富集效率，在人体生物样品的前处理上广泛应用[29-24]，而且能够对目标物进行高通量的分析。本文采用固相支撑液液萃取作为前处理方法，以人体血液中的啶虫脒、杀虫脒、吡虫啉为目标物，利用高效液相色谱质谱联用仪对目标物进行定性定量检验，结果表明，可以对生物体液中的啶虫脒、杀虫脒、吡虫啉进行快速高效的检验。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正戊烷、乙醚、乙腈、甲醇(色谱级，99.9%，德国Merck 公司) ; 醋酸钠和甲酸 ( 99.97 %，美国Tedia 公司) ; HCl( 质量分数为37%，德国Sigma-Aldrich 公司) ;实验用水为超纯水( 18.2 MΩ·cm) ; 吡虫啉（德国Dr 公司）；啶虫脒（中国ANPEL 公司）；杀虫脒（德国Dr 公司）；空白血1 份。

1.2 仪器

液相色谱仪( LC，日本岛津公司) -三重四极杆质谱仪( MS /MS，美国AB SCIEX 公司) ;台式离心机(美国Thermo Fisher 公司); 氮吹仪(瑞典Biotage 公司);6 孔固相萃取装置(中国睿科公司) ;超纯水仪(美国Millipore 公司) ; 振荡器（德国IKA 公司）;0.22 μm 尼龙膜滤头(德国CNW 公司) ; 5 mL SLE 固相支撑液液萃取小柱(瑞典Biotage 公司)。

1.3 溶液配制

混合标准工作溶液的配制：精确称取杀虫脒、啶虫脒、吡虫啉对照品适量，分别置于50 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容，充分摇匀的基础上超声促溶，配制成1 mg/mL 标准储备液，用移液枪各取适量标准储备液于甲醇水（V/V 1:1）中，配制成100 μg/mL 的标准工作液，备用。Ph 为10 的缓冲溶液配制：准确称取KH2PO40.064 g，Na2HPO45.020 g，于1000 mL 容量瓶中，用去离子水溶解并定容，充分摇匀，配制成Ph 为10 的缓冲盐溶液。

1.4 样品前处理

将样品解冻后，准确量取1 mL，加入1mL Ph 为10 缓冲溶液，振荡3 min，8000 r/min 离心5 min，取上清液，加入20ng 内标SKF525a，充分混匀。将样品加入固相支撑液液萃取小柱中，1 分钟内上样完毕，等待5 min，使样品分散并充分吸附于填料表面。以4 mL 乙酸乙酯冲洗萃取柱，连续洗脱2 次，将两次收集的洗脱液合并氮吹并吹干，以甲醇定容至400 μL。用0.22 μm 的尼龙膜过滤后，备检。

1.5 仪器分析

UPLC 色谱条件：色谱柱为Waters ACQUITY UPLC BEH C18（2.1mm×50mm，ID 1.7μm，美国Waters 公司）；流动相A：0.1%甲酸+5mmol/L 乙酸铵的超纯水；流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；进样体积：1μL；梯度洗脱程序：0～2 min，90 % B; 2～2.5 min，90 %～50% B; 2.5～3 min，50 % B; 3～3.5 min，50 %～90 %B; 3.5～6 min，90%B。质谱条件：电喷雾离子源(ESI )，正离子模式，多扫描方式：多反应监测（MRM）。质谱离子源参数：CUR：35；CAD：Medium；IS ：5500；TEM：450；GSI：50；GS2：50。

各目标化合物保留时间和定性定量离子对见表1。

表1 杀虫脒、吡虫啉、啶虫脒的质谱参数及色谱保留时间

2 实验条件优化

2.1 质谱条件的优化

结合杀虫脒、啶虫脒、吡虫啉的化学结构式，选择ESI(+)的电离模式，使用注射针泵分别注入500 ng/mL 的药物标准品。杀虫脒、啶虫脒、吡虫啉的分子量分别为196，222，255，在m/z 100-500 的扫描范围内进行全扫描，在一级全扫描质谱中得到母离子质量数[M+H]+的分子离子峰。调节仪器参数，分别选择[M+H]+作为母离子进行二级质谱扫描分析，自动优化确定最高及次高响应的二级离子m/z 以及相应的DP、CE、CXP 等参数，具体见表2。（质谱参数表1）。

2.2 色谱条件的优化

本论文分别研究了含有0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸铵和0.1%甲酸、5 mmol/L 醋酸铵的超纯水作水相；乙腈、甲醇作为有机相，以灵敏度和峰形作为评判条件，最终发现含有5 mmol/L 醋酸铵和0.1%甲酸的超纯水作水相，乙腈作为有机相，选择梯度洗脱，以相对高的流速低比例的有机相作为起始流动相，提高分析效率和灵敏度。

2.3 前处理方法优化

生物样品成分复杂，一般对目标物的干扰比较大，前处理的目的就是为了最大限度除去干扰，保证仪器性能的同时，获得较高的目标物回收率。本实验分别对比了3 种常用的前处理方法。(1)蛋白沉淀法：取0.5 mL 样品，加入2.0 mL 90 %（V/V）乙腈水沉淀蛋白，充分振荡10.0min 后，8000r/min 离心取上清液，过0.22μm 滤膜后直接进行仪器检测。(2) HLB 固相萃取法：准确移取血液0.5mL，加入pH=6 的缓冲溶液0.5mL。振荡1.0 min 后将混合液8000r/min离心取上清液，HLB 萃取住活化后，上样淋洗后先在5 000 r/min下离心5 min，然后氮吹吹干，乙酸乙酯洗脱，洗脱液氮吹吹干后用初始流动相溶解，过0.22 μm 尼龙滤膜后直接上样。(3) 固相支撑液液萃取法：准确移取样品血液0.5 mL，加入pH = 10 的缓冲溶液0.5mL。充分振荡1min 后上样，1min 内要完成上样全过程，使得样品全部均匀分散在填料上后，静置5.0 min 左右。用4mL*2 乙酸乙酯洗脱萃取柱，轻微加压，流速在1.0 mL/min 左右。合并两次洗脱液氮气吹干，用初始流动相定容至0.5 mL，过0.22 μm 尼龙膜，滤液供UPLC-MS/MS 分析。对比上述3 种前处理方法，乙腈直接沉淀蛋白法，容易产生基质效应，结果不稳定，回收率约为65 %，固相萃取法稍有不慎便会堵塞柱子，耗时长，回收率约为60 %。纵观固相支撑液液萃取法，提取效率高，操作简单，回收率能达到90% 以上，满足实际使用要求。

2.4 固相支撑液液萃取柱洗脱溶剂的选择

本实验选取了环己烷、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚作为洗脱溶剂进行优化，通过3 种目标物的回收率进行评价。相关结果见表2，二氯甲烷溶解性较大，易洗脱部分非目标物，乙醚沸点太低，易挥发，综合考虑，洗脱溶剂选择乙酸乙酯。

表2 固相支撑液液萃取柱洗脱溶剂的优化

2.5 方法评价

2.5.1 方法的线性范围、检出限和定量限

上述实验条件优化好后，进行方法学的考察。取空白全血5 份各0.5 mL，分别配制成5、10、50、100、500 ng/mL 标准品。经过固相支撑液液萃取法进行前处理后，进行仪器分析。以不同浓度目标物的峰面积进行线性回归，结果表明啶虫脒、吡虫啉、杀虫脒3 种药物在5～500 ng/mL 范围内有良好线性关系，相关系数为0.9983～0.9992，以3 倍信噪比（S/N）对应的添加水平作为检出限（LOD），10倍信噪比（S/N）对应的添加作为定量限（LOQ），结果见表3。