基于网络药理学探讨消痛汤治疗痛风的作用机制

胡子毅，张 平，李人亮，易 莹，赖俊宇，陈丽莎

(1.江西中医药大学附属医院 急诊科，江西 南昌 330006；2.江西中医药大学 临床医学院，江西 南昌 330004；3.江西中医药大学 中医学院，江西 南昌 330004；4.江西中医药大学 心血管病科，江西 南昌 33006)

痛风是由单钠尿酸盐(MSU)沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关，特指急性特征性关节炎和慢性痛风石疾病，主要包括急性发作性关节炎、痛风石形成、痛风石性慢性关节炎、尿酸炎肾病和尿酸性尿路结石，重者可出现关节残疾和肾功能不全[1-2]。原发性痛风的病因和发病机制尚不明确，发病多与遗传和环境因素相关。在我国各地区痛风的患病率为0.03%～10.47%[3]。目前临床上对此病的干预主要依靠使用药物和饮食控制相配合，严重者需行手术治疗[4]。

消痛汤系蒋小敏教授治疗痛风性关节炎的经验方，其药物组成：炒杜仲30 g，粉萆薢15 g，白术10 g，百合25 g，汉防己10 g，金钱草15 g，车前草15 g，威灵仙20 g土茯苓10 g，黄柏10 g，牡丹皮10 g，伸筋草15 g，忍冬藤30 g，生甘草6 g[5]。本课题组曾运用消痛汤加味对40例急性痛风性关节炎患者进行临床研究，结果表明消痛汤治疗急性痛风性关节炎具有较好的疗效，且具有一定的降尿酸作用[6]。但由于中药复方具有成分复杂和作用机理不清楚的特点，因此本研究拟采用网络药理学方法来探寻消痛汤中治疗痛风可能存在的关键活性成分和作用机制。

1 研究内容与方法

1.1 消痛汤活性成分的获取及靶点筛选

利用中药系统药理学分析平台(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)对消痛汤中中药的全部化学成分进行收集，通过限制口服吸收利用度(OB≥30%)、药物相似性(DL≥0.18)对中药的活性成分进行筛选[7]。然后将筛选好的候选活性成分在TCMSP数据库和SwissTarget Prediction 数据库(http：//swisstargetprediction.ch/)中收集蛋白靶点。最后通过Uniprot数据库(https：//www.uniprot.org/)进一步将收集到的蛋白靶点转化为对应的基因名称，获取与活性成分作用相关的蛋白靶点(人源)。

1.2 痛风的靶点筛选

以“gout”“gouty”“Acute Gouty Arthritis”为关键词，在Genecard数据库(https：//www.genecards.org/)、OMIM数据库(https：//omim.org/)、PharmGkb数据库(https：//www.pharmgkb.org/)、TTD数据库(http：//db.idrblab.net/ttd/)、DrugBank数据库(https：//www.drugbank.ca/)中进行检索，收集痛风的相关基因。

1.3 网络构建与分析

将获取到消痛汤活性成分的预测靶点与痛风疾病相关靶点进行Venn(维恩)分析，筛选出“药物-疾病”的交集基因。应用Cytoscape 3.8.0 软件构建消痛汤的“成分-靶点”网络图，探究消痛汤活性成分和相关靶点的相互作用。然后从Tools工具栏中“NetworkAnalyzer”模块选择Analyze Network功能，对药物进行拓扑分析。在String 数据库(http：//stringdb.org/)，通过交集得到的靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络。物种设为“Homo sapiens” (人类)，最低相互作用阈值设为最高置信度0.9 “highest confidence”，其余参数保持默认设置。然后把PPI网络计算出的数据导入Cytoscape 3.8.0 软件，利用其Apps工具栏中的CytoNCA功能对其进行打分，筛选出核心基因。

1.4 基因本体论(GO)与京都基因和基因组百科全书(KEGG)富集分析

应用 R 4.0.2软件中的BiocManager软件包对上述交集基因进行GO和KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 活性成分筛选及靶点筛选

本研究中通过TCMSP数据库获得消痛汤中杜仲、粉萆薢、白术、百合、防己、金钱草、车前草、威灵仙、土茯苓、黄柏、牡丹皮、伸筋草和甘草13味药物中的化学成分，通过限定OB≥30%和DL≥0.18进行筛选，共得到234个活性成分，其中杜仲28个、粉萆薢2个、白术7个、百合7个、防己3个、金钱草10个、车前草10个、威灵仙7个、土茯苓15个、黄柏37个、牡丹皮11个、伸筋草5个和甘草92个。剔除未找到靶点的化学成分后，共得到156个，见表1。

表1 消痛汤“中药-活性成分-预测靶标”信息

2.2 疾病靶点筛选结果

通过Genecard数据库、PharmGkb数据库、OMIM数据库、TTD数据库和DrugBank数据库筛选出与痛风疾病相关基因830个。

2.3 网络构建与结果分析

将所得到的温胆汤的药物靶点与痛风疾病相关靶点进行映射，得到146个共有靶点，见图1。借助Cytoscape 3.8.0软件构建药物-靶点网络，见图2。对药物-靶点网络的拓扑属性进行分析，筛选出度值与介数均大于平均值的化合物，结果筛选出槲皮素、山柰酚、木樨草素、柚皮素、吴茱萸次碱等15种化合物，提示这些成分可能是消痛汤治疗痛风疾病的主要活性成分，见表2。利用String数据库将映射所得的146个靶点制作成 PPI 网络，限定其置信度为0.9，其产生相互作用的网络有142个节点、558条边，平均节点度：7.86，平均局部聚类系数：0.526，见图 3。应用Cytoscape软件的Apps工具栏中的CytoNCA功能对PPI网络数据进行分析，筛选出12个核心基因，即TNF、IL1B、IL6、IL10、CCL2、CCL5、TIMP1、STAT3、CXCL1、PF4、CXCL8、VEGFA，说明这12个基因可能是消痛汤治疗痛风的关键靶标，见图4。

图1 消痛汤与痛风的共有靶点

注：靶点；○成分。分别代表：1.白术；2.车前草；3.杜仲；4.防己；5.粉萆薢；6.甘草；7.黄柏；8.金钱草；9.牡丹皮；10.伸筋草；11.土茯苓；12.威灵仙

表2 化合物拓扑分析结果

图 3 消痛汤治疗痛风疾病的PPI网络

图 4 PPI网络中的核心基因

2.4 GO和KEGG通路富集分析

应用R软件的BiocManager软件包对消痛汤治疗痛风的交集基因进行GO分类富集和 KEGG通路富集分析。依据P<0.05 进行GO和KEGG通路富集分析，其中富集靶标越多、P值越小的通路，与消痛汤治疗痛风的关系越密切，分别筛选出前10条GO条目和前20条KEGG通路。GO分类富集分析包括细胞组分(cellular component，CC)、生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)3个部分。通过GO分类富集分析确定了2 319个条目，其中涉及生物过程2 160条，主要参与对脂多糖的反应、对细菌来源分子的反应、细胞因子产生的正调控、肽基-酪氨酸磷酸化的正调控、肽分泌的调节、细胞对脂多糖的反应、炎症反应的调节、细胞对细菌来源分子的反应、蛋白质分泌的调节、受体信号通路通过JAK-STAT的正调控等；涉及细胞组分44条，主要包括质膜的外侧面、囊腔、分泌颗粒腔、胞质小泡腔、血小板α颗粒管腔、血小板α颗粒、含胶原蛋白的细胞外基质、内质网内腔、MHC蛋白复合物、三级颗粒腔等；涉及分子功能114条，主要包括受体配体活性、信号受体激活剂活性、细胞因子活性、细胞因子受体结合、氧化还原酶活性、类固醇羟化酶活性、生长因子活性、生长因子受体结合、血红素结合等，见图5。通过KEGG 通路富集分析，找到了112条信号通路，主要包括风湿性关节炎、细胞因子-细胞因子受体间质、炎症性肠病、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路、结核病、美洲锥虫病、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、甲型流感、JAK-STAT信号通路、人巨细胞病毒感染、利什曼病、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、弓形虫病、疟疾、百日咳、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、阿莫伊比阿斯病、NF-κB信号通路、化学致癌作用、HIF-1信号通路等，见图6。

图 5 GO分类富集分析结果

3 讨论

本研究筛选出消痛汤与痛风疾病的交集基因有146个，构建出药物-疾病靶点网络图后，通过拓扑分析找出槲皮素、山柰酚、木樨草素等15种主要活性成分。黄嘌呤氧化酶(XOD)是人体内产生尿酸的关键酶，其抑制剂可用于治疗高尿酸血症和痛风，研究表明槲皮素对XOD催化的尿酸和超氧阴离子自由基(O2-)的生成有可逆性抑制作用[8-9]。ARSHAD MEHMOOD等[10]研究发现，在黄酮类化合物中木犀草素和黄芩素具有较强的抑制作用，黄酮醇类化合物中山奈酚、槲皮素、异鼠李素-3-O-葡萄糖苷具有抑制作用。尿酸转运蛋白1(URAT1)是一种生理上重要的肾脏尿酸转运蛋白，在尿酸盐重吸收中起重要作用[11]。沈瑞明等[12]研究发现，木犀草素可通过下调TLR/MyD88/NF-κB通路减轻急性痛风性关节炎的炎症反应。YU TOYODA等[13]研究发现，柚皮素对URAT1具有强烈的抑制作用，能降低尿酸盐相关疾病的风险。

图 6 KEGG通路富集分析结果

本研究将146个药物-疾病交集基因构建出PPI网络，再根据CytoNCA功能筛选出了IL1B、IL6、TNF等12个核心基因。晶体相关的关节疾病通常与全身炎症症状有关[14]。全基因组关联研究(GWAS)表明，高尿酸血症的遗传基础是由含尿酸转运蛋白的基因座主导的，这些转运蛋白参与了肾脏和肠道排泄尿酸盐的过程；候选基因研究已经检测到编码影响NLRP3(NOD-，LRR-和含吡啶多聚体-3)炎症体的激活和活性的基因与痛风的关联[15]。白细胞介素-1β(IL1B)在痛风的炎症发生过程中起重要作用，并且已知在MSU晶体刺激后，从巨噬细胞中大量释放[16]。内源性细胞因子IL-6参与MSU介导的NLRP3炎性小体活化和随后的先天免疫细胞产生IL-1β，并且在MSU晶体诱导的滑膜炎症中起关键作用。肿瘤坏死因子(TNF)在痛风性关节炎的发病机制中发挥着重要作用，其机制包括诱导IL-1活化、增强白细胞介素-6(IL-6)介导的炎症反应、激活核因子(NF-κB)炎症信号通路、参与慢性痛风性关节炎的骨骼破坏与侵蚀，以及与中性粒细胞的相互作用[17]。

本研究通过KEGG通路富集分析找到了与痛风密切相关的信号通路，如IL-17信号通路、TNF信号通路、JAK-STAT信号通路、Th17细胞分化、NOD样受体信号通路、Toll样受体信号通路、NF-kB信号通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路、HIF-1信号通路等。这些通路在痛风的炎症发生以及代谢性障碍中起重要作用。

本研究运用网络药理学方法对消痛汤治疗痛风进行了分析，初步揭示了消痛汤治疗痛风的潜在活性成分、作用网络和潜在作用机制，为进一步探讨其发挥作用的药效物质基础和作用机制提供了研究方向，其后续研究尚需系统的靶点验证和体内外实验，以证实其功效网络的内在关联和作用靶点集合。