山茶油皂苷抗炎及抗菌作用研究

冯秋瑜，覃钦成，白燕远*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530200；2.广西壮瑶医药与医养结合人才小高地，广西 南宁 530200)

山茶油在日常生活中是一种食用油，但是不少专家和学者经过实验研究发现，山茶油具有很高的药用价值。《本草纲目》记载山茶油具有润肠、清肺、祛痰等功效，“茶油性寒凉，味甘平，润肠通便，清热化湿，润肺祛痰，利头目”。《纲目拾遗》认为其具有杀虫润肠等作用，能“润肠清胃，杀虫解毒”[1]。《农政全书》中描述山茶油“疗疮疥，退湿热”。《中国药典》将山茶油收录其中，认为其是一种软膏基质和注射用茶油的原料。现代临床对山茶油的功效和作用进行研究，发现山茶油能够降血压、降血脂以及对心脑血管疾病的预防具有较好效果。同时，山茶油还能够清热解毒、杀菌、抵抗紫外线，能够有效预防皱纹和晒斑，所以也常将其应用于皮肤科的治疗中[2]。随着人们对自然的崇尚，天然抗菌以及抗炎剂的开发成为近年来临床关注的热点[3-4]。本实验重点研究山茶油抗菌消炎的活性成分，深入开发山茶油作为皮肤科用药的应用领域，助推广西山茶油产业化发展，使山茶油的应用价值得到更充分体现。

1 材料与方法

1.1 动物

共48只实验小鼠，均购自广西医科大学动物中心，合格证号：SCXK(桂)2020-0031，雌雄各半，适应环境饲喂5～7 d。

1.2 山茶油皂苷制备

由广西中医药大学壮瑶药重点实验室黄慧学副教授通过乙醇热回流方法提取得到，经测定皂苷含量为66.3%。

1.3 供试菌种

大肠埃希菌EC(Escherichia coli，购自广东环凯微生物科技有限公司)；白色念珠菌MA(Monilia albicans，购自广东环凯微生物科技有限公司)；肠炎沙门氏菌SE(Salmonella enteritidis，购自上海烜雅生物科技有限公司)；英诺克李斯特菌LM(L.monocytohenes，购自广东环凯微生物科技有限公司)；须癣毛癣菌TM-p(Trichophyton mentagrophyte，购自上海烜雅生物科技有限公司)。

1.4 试剂

齐墩果酸(购自成都曼思特生物科技有限公司)；佛波酯(TPA，购自北京索莱宝生物科技有限公司)；TNF-α、IL-6、IL-1β酶联免疫吸附(ELISA) 试剂盒，均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司。

1.5 抗炎模型建立以及小鼠给药方案

将48只小鼠随机分为6组，分别为空白对照组，模型对照组，地塞米松组(采用地塞米松治疗，剂量为2.5 mg/kg) 和山茶油皂苷低、中、高剂量组(剂量分别为10.0 mg/kg、20.0 mg/kg和40.0 mg/kg)。除空白对照组外，其余各组在小鼠右耳内外侧涂抹20 μL佛波酯致炎。并于造模同时，地塞米松组、山茶油皂苷组小鼠均在右耳内外侧涂抹相应药液，每天1次，连续5 d，空白对照组和模型对照组小鼠涂抹等体积生理盐水。

1.6 小鼠耳肿胀程度测定

小鼠给药6 h后，采用厚度测定仪(数字测厚仪)对小鼠两只耳朵的厚度进行测定，测量结果为每只小鼠测量2只耳朵的厚度差值。

1.7 小鼠耳朵组织中TNF-α、IL-6、IL-1β指标测定

取小鼠相同部位的耳组织，对其称重，留作备用。然后取一定质量的耳组织，加入一定量生理盐水，其中质量(g)∶体积(mL)=1∶9。将耳组织做剪碎处理，并制作成组织匀浆，浓度为10%，最后做离心处理。离心处理好后，根据ELISA试剂盒使用说明和操作步骤，对离心后的耳组织上清液进行分析，测量耳组织中3种指标的水平。

1.8 最小抑菌浓度(MIC)测定

根据微量肉汤稀释法，将待测山茶油皂苷提取液过滤除菌，2倍稀释法将其用培养基稀释成80.000～0.001 mg/mL稀释液。取微量稀释板(96孔)，每孔加入50 μL稀释样品液以及菌悬液，以100 μL剂量的不加样品液且含菌培养基作对照，每组3个平行。EC、SE、LM在37 ℃下培养18～24 h，MA在25 ℃下培养48 h，TM-p于25 ℃ 条件下培养7 d。观察孔板测试菌生长状态，与对照孔比较发现，菌生长被抑制，培养基清亮采用的最低药物浓度值为山茶油皂苷最小抑菌浓度值。

1.9 统计学方法

2 结果

2.1 山茶油皂苷对小鼠耳肿胀程度的影响

与模型对照组相比，地塞米松组、山茶油皂苷组均能显著降低小鼠耳厚度(P<0.05)，且山茶油皂苷高剂量组(40.0 mg/mL)耳肿胀抑制率与地塞米松组相当(P>0.05)，见表1。

表1 山茶油皂苷对小鼠耳肿胀程度的影响

2.2 耳组织中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

山茶油皂苷高剂量能够改善耳组织中炎症细胞浸润，减少TNF-α、IL-6、IL-1β含量，且呈剂量依赖性(P<0.05)，见表2。

表2 耳组织中 TNF-α、IL-6、IL-1β含量

2.3 山茶油皂苷抑菌结果

山茶油皂苷对5个测试菌种均具有较好的抑菌能力，尤其是对须癣毛癣菌具有较优越的抑菌活性，MIC=0.005 mg / mL，详见表3。

表3 山茶油皂苷抑菌结果

3 讨论

山茶油浑身是宝，且具有明确的抗炎抗菌作用。在本研究中，采用TPA致小鼠耳肿胀模型对山茶油皂苷抗炎活性结果显示，地塞米松和山茶油皂苷局部治疗TPA致小鼠耳肿胀，均显著降低了小鼠耳肿胀程度(P<0.05)，且山茶油皂苷高剂量组(40.0 mg/mL)耳肿胀抑制率与地塞米松组相当(P>0.05)，表明山茶油皂苷具有较好的抗炎作用。林朝悦等[5]采用角叉菜胶引起小鼠足趾肿胀，经茶油治疗后，发现其对于消除肿胀和抗炎效果较好。对研究结果进行分析，推断出现这种结果的原因在于茶油对于小鼠体肿胀足内的丙二醛具有显著降低效果，同时提高了SOD的整体活性，在抗炎的过程中可释放出自由基，这有助于减轻小鼠体内组织的氧化反应。

人体炎性因子重要指标参数包括TNF-α、IL-6，前者主要出现在炎性反应初期，主要作用在于促进中性粒细胞、淋巴细胞的释放，同时还可以促进IL-6释放。TNF-α还作为反应炎症程度的重要指标，直接反映患者体内发生炎症的严重程度[6]。IL-6能够活化蛋白激酶，从而影响到转录激活因子，对于炎症反应的进程起到促进作用。IL-1β能够促进免疫应答，也直接参与到人体炎性反应的过程中，提高了人体NK细胞的杀伤能力，有助于提高巨噬细胞产生IL-2、IL-6[7]。本实验发现，山茶油皂苷的不同剂量组均能够降低TNF-α水平，且差异有统计学意义(P<0.01)，其中中剂量、高剂量组可明显降低IL-6、IL-1β水平(P<0.05)，表明山茶油皂苷的抗炎过程和作用机理可能与抑制炎性因子TNF-α、IL-6的正常表达有一定的关联性，在一定程度上能够有效抑制炎症的恶性反应，有助于遏制炎症反应过程，防止组织因为炎症反应而进一步损伤。

山茶油具有一定的抑菌效果，常应用于细菌、霉菌、酵母的抑菌过程中。大量临床研究发现，其对不同菌种的抑菌浓度不尽相同，如对金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、大肠埃希菌、黑曲霉和米曲霉、枯草芽孢杆菌的浓度值分别为3%、1%、4%、3%和7%[8-9]。抑菌效果与氨苄青霉素相同，同时其热稳定性较高，不受pH差异影响。本实验选择代表性菌种做试验，结果表明山茶油皂苷对环境有害菌具有抑菌能力，尤其对须癣毛癣菌效果最好，MIC为 0.005 mg/mL，因此，山茶油皂苷对有害菌具有较好抑菌活性。

除了具有抑菌、抗炎效果，山茶油还具有促进药物吸收的功效。王爱萍等[10]发现山茶油可直接影响皮肤结构，对皮肤的屏障效果具有减弱效果，渗透性强，这样有助于药物通过皮肤吸收。研究发现山茶油的组织成分与人体皮肤较为类似，所以两者的相容性较好，无刺激性[11]。相关研究显示，山茶油能够促进氟比洛芬在皮肤组织中的吸收率，从而有效提高药物经皮渗透能力[12，13]。

综上所述，山茶油皂苷在体外显示对TPA致小鼠耳肿胀模型具有较强的抗炎作用，可能与抑制炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β合成与释放有关，并对多种菌有一定抑菌作用。