MT2-MMP在Ⅱ期肺腺癌中的表达及临床意义

王俊美 潘慧卿 李婧铱 贾迪 赵炜明 吕昌莲

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一[1]，其中腺癌是临床中常见的肺癌亚型[2]。研究影响肿瘤进展的分子表达对早期患者的诊断和治疗有重要意义。基质金属蛋白酶家族(Matrix metalloproteinases，MMPs)与肿瘤进展相关[3-4]。其功能是水解细胞外基质、细胞表面结合的生长因子以及粘附蛋白等[5]，参与人体多种生理及病理过程，如炎症、胚胎发育、血管形成、肿瘤侵袭转移等[6-7]。MMPs共有28个亚型，分为分泌型和细胞膜锚定型两大类，其中分泌型MMPs研究已较为清楚，而细胞膜锚定型(如MT1-MMP、MT2-MMP等)研究起步较晚，目前主要集中于MT1-MMP的研究，而MT2-MMP的研究相对较少。

MT2-MMP在多种癌组织和细胞系呈高表达，发挥不同的病理生理作用。在宫颈癌细胞系HeLa S3细胞高表达，发挥抗凋亡作用[8]。在胃癌促进胃癌恶性进展并影响预后[9]。在食管癌表达水平与肿瘤大小和瘤内血管生成呈正相关[10]。在非小细胞肺癌中表达增加，与淋巴结转移、肿瘤分期、血管生呈正相关[11]，但是该研究样本量过小，其中肺腺癌10例，肺鳞癌11例，TNM各分期的样本量也很少，肺腺癌与肺鳞癌Ⅱ期与Ⅲ期总共10例。针对非小细胞肺癌研究的不足，结合TNM Ⅱ期在临床上发病率比I期发病率高，且MT2-MMP可能影响肿瘤进展和预后，因此需要对II期进行更充分的研究，以明确MT2-MMP在肺腺癌中的表达情况及其临床意义。

1 材料和方法

1.1 样本收集

收集2006年1月—2007年12月哈尔滨医科大学附属肿瘤医院收治的TNM病理分期Ⅱ期肺腺癌40例，所有样本均经两名病理科医生诊断，癌旁正常组织作为对照组，进行HE染色和免疫组化半定量分析。标本均经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片。

1.2 HE染色

将石蜡切片放入浸泡用的玻璃缸，经二甲苯(Ⅰ、Ⅱ，分别15 min)浸泡脱去切片中的石蜡，再经由高浓度至低浓度(100%、95%、90%、80%、70%、50%，分别1 min)的梯度乙醇浸泡水化，最后转移至自来水冲洗2 min。浸泡苏木素5 min染色，再自来水洗1 min，分化液10 s，自来水清洗10 min。浸泡伊红染色液2 min后将切片浸于梯度乙醇脱水，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)透明。封片干燥后即于光学显微镜下观察癌组织及癌旁正常组织的形态。

1.3 免疫组化检测MT2-MMP表达

所收取的肺腺癌组织标本经HE染色证实符合癌组织形态结构特征后，将石蜡切片放置在60℃烘箱中烘片至少60 min，二甲苯(Ⅰ、Ⅱ)多次脱蜡，再经由高浓度至低浓度的梯度乙醇浸泡水化，最后转移至自来水或PBS冲洗2 min。加入适量枸橼酸钠抗原修复液，在高压锅中加热煮沸并冷却，漂洗修复好的石蜡切片3次，每次5 min，封闭内源性过氧化氢酶、封闭内源性抗原，进行MT2-MMP(1∶200)一抗4℃孵育过夜、二抗室温孵育2 h，滴加适量生物素底物放大信号，然后DAB显色、苏木精复染，最后组织脱水、石蜡透明、封片扫描检测MT2-MMP的蛋白表达，分析MT2-MMP在癌组织的表达情况。根据肿瘤实质细胞MT2-MMP染色强度及细胞阳性率对染色结果计分：0分≤阴性≤0.4分、0.5<阳性≤4分，并以2.5分为界将阳性结果的癌组织样本进一步分为MT2-MMP高、低表达组。

1.4 TCGA数据库分析

从UCSC(https：//xena.ucsc.edu/public)下载获得TCGA肺腺癌的基因表达谱以及肺腺癌样本的临床信息。获得肺腺癌515个疾病样本和59个癌旁样本，使用临床表型信息将疾病样本分为了3个阶段，包括TNM分期Ⅰ期(307)，TNM分期Ⅱ期(153)和TNM分期Ⅲ/Ⅳ(125)。基因表达数据使用log2(RSEM+1)进行量化，差异分析使用t检验。

1.5 统计分析

使用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，计数资料用百分数表示，组间比较采用卡方检验，配对资料分析采用配对t检验，P<0.05为差异具有统计学意义，采用Image J软件绘图。

2 结果

2.1 MT2-MMP在肺腺癌组织中的表达

HE染色结果显示癌组织表现出明显的无序增殖特征，肺腺癌细胞多呈小条索状排列，形成腺管样结构，具有明显的肺癌组织特征。MT2-MMP免疫组化染色结果显示在肺腺癌肿瘤实质细胞呈现明显的棕黄色染色，表明MT2-MMP在肺腺癌中呈高表达，在癌旁正常组织中呈低表达或不表达(图1)。

图1 肺腺癌及癌旁正常组织HE染色和免疫组化分析(200×)

分析40对肺腺癌组织样本MT2-MMP免疫组化染色结果，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中的MT2-MMP表达量明显增高(P<0.01)，提示MT2-MMP表达上调可能与肺腺癌有关(图2)。

图2 MT2-MMP在肺腺癌与癌旁正常组织中的相对表达量

2.2 MT2-MMP表达与肺腺癌患者临床信息的相关性

将40例肺腺癌组织样本MT2-MMP表达情况与性别、年龄、肿瘤大小、是否有淋巴转移等临床信息进行分析，结果显示MT2-MMP高表达组与MT2-MMP低表达组患者间肿瘤大小存在统计学差异，性别、年龄、是否淋巴转移与MT2-MMP表达无关(P>0.05)(表1)。

表1 MT2-MMP表达与肺腺癌临床特征分析

2.3 TCGA数据库分析

TCGA数据库分析结果显示肿瘤组织相比癌旁组织，MT2-MMP表达上调(P<0.001)(图3)。不同TNM分期阶段的癌症样本与癌旁样本MT2-MMP表达相比(图4)，不同TNM分期阶段的癌组织样本MT2-MMP表达均上调，差异具有统计学意义(P<0.01)，表明MT2-MMP的表达与肺腺癌相关。但不同TNM分期阶段癌症样本之间MT2-MMP表达差异不具有统计学意义(P>0.05)，推测可能与不同分期癌组织的大小与转移情况的复杂性及所呈现不同的特征有关。

图3 TCGA数据库分析肺腺癌组织与癌旁组织中MT2-MMP表达情况

图4 TCGA大数据分析不同分期肺腺癌MT2-MMP表达情况

3 讨论

肺腺癌的发生发展常伴有基因突变、蛋白异常表达[12-14]，以及细胞内复杂信号通路异常激活[15]。肺腺癌的进展是一个多阶段性过程，包含肿瘤细胞原位增殖、侵袭、循环扩散、远处克隆和血管生成。在这一系列的进展过程中，细胞外基质的降解是其中的关键步骤之一，只有完成了对细胞外基质的降解，肿瘤细胞才能向周围组织侵袭并进入循环系统，进一步进入远端的器官组织定植形成转移灶。一旦发展为晚期肺癌，其侵袭及转移进展无法遏制且对常规化疗药物耐受性和敏感性较低，导致预后极差[16]，因此寻找肺癌早期的诊断标志物具有重要意义。

多项研究证据表明，基质金属蛋白酶在降解细胞外基质过程中起到关键作用。MT2-MMP作为基质金属蛋白酶家族中的一员可能发挥重要作用。MT2-MMP基因全长3530bp，位于16号染色体上，编码产生MT2-MMP蛋白。MT2-MMP蛋白定位于细胞膜表面，多肽链由669个氨基酸组成，包含疏水信号肽序列、前肽区、催化区、铰链区和羧基末端区，具有锌离子、钙离子的结合位点。其功能不仅可以水解细胞外基质，降解癌细胞之间的E-钙粘蛋白导致上皮间质转化[17-18]，同时还可以参与细胞内外信号调节，激活其他MMPs酶原(如明胶酶A)变成活化酶[19]。目前已证实MT2-MMP在肺癌、宫颈癌、胃癌、食管癌、乳腺癌[20]、结直肠癌[21]及急性骨髓性白血病[22]中均高表达，并与多种恶性肿瘤的预后有关。有研究发现MT2-MMP可以直接赋予无侵袭能力的细胞穿透I型胶原蛋白基质的能力[23]，参与癌细胞的侵袭和转移[24]。Tao等[25]报道MT2-MMP为上皮-间充质转化进程(EMT)中Snai1的一个直接靶点。Gómez等[26]报道MT2-MMP的胞质结构域结合ZO-1，从而允许蛋白酶在上皮连接处裂解E-钙粘蛋白，同时促进上皮细胞增殖。此外，MT2-MMP还可以激活MMP-2从而发挥抗细胞凋亡的作用，Reimar等[8]发现MT2-MMP以不依赖TIMP-2的方式结合MMP-2的HPX结构域。

在肺癌组织中，对MT2-MMP的研究还十分有限。Kobayashi等[27]研究发现，与支气管上皮细胞与Ⅱ型肺泡细胞相比，MT2-MMP在肺腺癌细胞中表达上调。Chen等[11]研究发现，非小细胞肺癌组织中的MT2-MMP表达在mRNA水平和蛋白水平均升高，且与肿瘤内血管密度(MVD)相关，但是该研究样本量过小，需要进行更充分的研究。考虑到TNM Ⅱ期在临床上发病率比I期发病率高，本研究选取40对Ⅱ期肺腺癌的癌组织样本，通过免疫组化染色观察到癌组织MT2-MMP表达明显高于癌旁正常组织，同时发现在癌组织中MT2-MMP的表达有高表达和低表达两种情况，但以高表达为主。进一步通过TCGA大数据进行验证，发现肺腺癌MT2-MMP表达比癌旁组织明显上调，与本研究免疫组化染色结果相同。另外，MT2-MMP表达与肺腺癌肿瘤大小呈正相关，表明MT2-MMP表达水平可能与肺腺癌的发生发展相关。虽然不同分期的癌症样本相比癌旁其表达均上调，但不同分期癌症样本之间表达没有显著差异，分析原因可能与T3、T4肿瘤的复杂性有关，因为T2的分期主要以肿瘤的大小为考量因素结合少量的淋巴结转移，而T3、T4的考量因素较为复杂，主要以转移(淋巴转移与远端器官转移)为考量因素，因此判断MT2-MMP与分期是否相关，应该采取更精细的样本分类进行分析。

综上所述，MT2-MMP在肺腺癌中高表达，并与患者肿瘤大小有关，可以考虑作为肺腺癌Ⅱ期的诊断标志物，进行肺腺癌的早期筛查。MT2-MMP可能促进肺腺癌的发生发展，但由于本研究样本量并不充足，无法进行生存分析等缺点，需要搜集资料更完备的样本深入研究MT2-MMP的表达、作用及分子机制。