活血消 益气方对肝硬化门静脉高压症大鼠肝功能及血清PDGF、TGF-β1、CTGF的影响

吴晓玲　　李力强　　段文彪　　吴伟斌　　杨坚　　胡钰颖

[摘要] 目的 探讨活血消癥益气方对肝硬化门静脉高压症模型大鼠门静脉压力、肝功能及血清PDGF、TGF-β1、CTGF的影响及其作用机制。 方法 采用四氯化碳复合法诱导构建肝硬化门静脉高压症大鼠模型，然后采用普萘洛尔及活血消癥益气方分别干预治疗8周。治疗结束后采用直接穿刺门静脉法测定大鼠的门静脉压力，取肝组织采用HE及Masson染色观察肝组织纤维化及门静脉曲张情况，取下腔静脉血检测大鼠肝功能及肝纤维化相关因子的水平。 结果 ①活血消癥益气方能显著改善纤维化大鼠的体重下降。②活血消癥益气方能显著改善肝组织纤维化、重建正常肝小叶，减轻肝细胞炎症浸润程度，减少结缔组织增生，肝细胞索排列基本整齐。③活血消癥益气方可显著改善肝纤维化大鼠的肝功能情况（P<0.05）。④活血消癥益气方能显著降低肝纤维化大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF等纤维化相关因子及门静脉压力的水平（P<0.05）。 结论 活血消癥益气方能有效改善肝硬化门静脉高压症模型大鼠门静脉压力、肝功能损伤、肝纤维化，作用机制可能与调控血清PDGF、TGF-β1、CTGF水平有关。

[关键词] 活血消癥益气方;肝硬化门静脉高压症;血小板衍生生長因子;转化生长因子-β1;结缔组织生长因子

[中图分类号] R965.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2021）13-0037-05

The effect of Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe on liver function and serum PDGF，TGF-β1， CTGF in rats with cirrhosis portal hypertension

WU Xiaoling   LI Liqiang   DUAN Wenbiao   WU Weibin   YANG Jian   HU Yuying

Zhaoqing Medical College， Zhaoqing   527400， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe on portal venous pressure，liver function，serum PDGF， TGF-β1， and CTGF in cirrhosis portal hypertension model rats and the mechanism of action. Methods The rat model of cirrhosis portal hypertension was induced by the carbon tetrachloride complex method，and then the rats were respectively interfered with propranolol and Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe for eight weeks. After treatment， the portal vein pressure of rats was measured by the direct portal vein puncture method. Liver tissues were taken to observe liver fibrosis and portal varicose vein by HE and Masson staining. The lower venous blood in rats was taken to detect liver function and the level of hepatic fibrosis-related factors. Results （1）Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe significantly improved the weight loss of rats with fibrosis. （2）Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe can significantly improve liver tissue fibrosis， rebuild normal liver lobules， reduce the degree of inflammatory infiltration of liver cells， reduce the proliferation of connective tissue， and the arrangement of liver cell cord was basically orderly. （3）Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe significantly improved the liver function of liver fibrosis rats （P<0.05）. （4）Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe significantly reduced serum levels of fibrosis-related factors such as PDGF， TGF-β1， CTGF， and portal venous pressure in hepatic fibrosis rats（P<0.05）. Conclusion Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe can effectively improve portal venous pressure， liver function damage， and liver fibrosis in cirrhosis portal hypertension model rats，and the mechanism of action may be related to regulating serum levels of PDGF， TGF-β1， and CTGF.

[Key words] Huoxue Xiaozheng Yiqi Recipe; Cirrhosis portal hypertension; Platelet derived growth factor;Transforming growth factor-β1; Connective tissue growth factor

门静脉高压症（Portal hypertension，PH）是一组以门静脉血流系统异常变化为特点的症候群，各种原因所致的肝硬化为其最常见病因，食管胃底曲张静脉破裂出血为门脉高压症的主要并发症[1]。近50%门静脉高压症患者可出现食管胃底静脉曲张，发生率与肝功能损害的严重程度有关[2]。门静脉高压症的治疗方法包括药物、介入、内镜和手术治疗等，门静脉高压症应遵循个性化治疗原则，筛选能改变纤维化发展过程、应用于肝硬化早期及肝纤维化患者的药物是关键[3]。鳖甲消癥丸是广东省名中医李力强教授发明的一种治疗肝病的中药院内制剂（粤药制字Z20070356，ZL20150670167.3），具有活血消癥益气之功效，在临床实际应用已30余年，该药能有效抗肝纤维化、预防肝硬化食管胃底静脉曲张破裂出血[4-5]。为探索其作用靶点和疗效機制，进一步提高临床疗效，本研究观察了鳖甲消癥丸原方中药配方颗粒剂对肝硬化模型大鼠门静脉压力（Portal venous pressure，PVP）、肝功能、血清血小板衍生生长因子（Platelet-derived growth factor，PDGF）、转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1，TGF-β1）、结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor，CTGF）的影响，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择SD大鼠40只[实验动物许可证号SYXK（鄂）2017-0065，湖北省疾控中心动物实验中心提供]为实验对象，雌性和雄性大鼠各一半，体重（304.20±6.12）g，适应性饲养1周，采用随机数字表法分为空白组大鼠10只和造模组大鼠30只。选择造模成功的大鼠24只，随机分为模型组8只、普萘洛尔组8只、实验组8只;空白组8只入组观察。

中药配方颗粒（批号1808001w，华润三九医药股份有限公司）、普萘洛尔片（国药准字H32020133，批号B180905，江苏亚邦药业集团股份有限公司），四氯化碳（货号C805332，上海麦克林生化科技有限公司），高脂饲料（湖北省疾控中心动物实验中心），苏木精-伊红（Hematoxylin-Eosin）染色试剂盒、马松（Masson）三色染色试剂盒（大连美仑生物技术有限公司），谷丙转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase，AST）、总蛋白（Total protein，TP）、清蛋白（Albumin，ALB）、总胆红素（Total bilirubin，TBIL）检测试剂盒（货号C010-2-1、C009-2-1、A045-2-2、A028-2-1、C019-1-1，南京建成生物工程研究所），CTGF/PDGF ELISA试剂盒（货号TL-E0084R，广州天元生物科技有限公司），TGF-β1 ELISA试剂盒（货号SEKR-0009，深圳市达科为生物工程有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物造模  参考相关文献采用四氯化碳复合法诱导造模[6]：以50°食用白酒加蒸馏水稀释成5%白酒溶液，造模组大鼠给予白酒溶液和高脂饲料进行饲养;按照0.2 mL/100 g体重，每周的第1天及第4天以四氯化碳橄榄油溶液灌胃1次，第1～2 周和第3～12周四氯化碳橄榄油溶液浓度分别为40%（v/v）和50%（v/v）。空白组大鼠给予普通饲料及蒸馏水喂养，同时给予等量的橄榄油溶液灌胃。每周的第1天大鼠称重1次，灌胃剂量根据大鼠体重每周调整。在第12周末，随机在造模组、空白组中各抽取2只大鼠，处死后取下腔静脉血，检测两组大鼠血清ALT、AST的含量，分离出大鼠肝脏，观察肝脏肿胀程度，再取肝组织进行HE染色及Masson染色，以造模组大鼠肝组织可见大小不等的假小叶为造模成功。

1.2.2 干预方法  各组大鼠每日的给药剂量参考《药理实验方法学》[7]进行换算。普萘洛尔组大鼠以10 mg/kg剂量给予普萘洛尔治疗。将普萘洛尔放入研钵，加少量温水研磨成为混悬液，再加入适当体积的温水配置成灌胃液，以1 mL/200 g体重剂量给予大鼠灌胃治疗。实验组给予活血消癥益气方中药配方颗粒进行灌胃干预治疗，方药组成：醋鳖甲1.5 g（相当于饮片15 g）、醋莪术1.5 g（饮片15 g）、醋三棱1.5 g（饮片15 g）、西洋参4.5 g（饮片15 g）、炙黄芪1 g（饮片10 g）、醋白芍1.5 g（饮片15 g）、炒白术1.67 g（饮片10 g）、茯苓1 g（饮片10 g）、生大黄0.5 g（饮片5 g）、生甘草1.25 g（饮片7.5 g）、人工麝香0.5 g，配方颗粒融入120 mL沸水中震荡摇匀为混悬液，冷却后按照1.23 mL/100 g体重灌胃。空白组和模型组大鼠给予等量的生理盐水灌胃。全部大鼠每日干预1次，连续干预8周。

1.3 观察指标

1.3.1 体重检测及症状  将1 L大烧杯置于电子天平上，去皮后取下，将大鼠置于大烧杯内，重新放置在天平上，待大鼠安定后读取测量值。每日观察记录1次大鼠的进食、毛发色泽、活动状态等基本情况。

1.3.2 标本采集及指标检测  ①门静脉压力（PVP）检测方法：大鼠禁饮食8 h，乌拉坦麻醉后切开腹部，充分暴露门静脉主干，用PE-50导管穿刺门静脉主干，接通压力传感器，连接多通路记录仪，测量3次平均值为门静脉压力。②肝脏HE染色法及Masson染色法：处死大鼠后取肝脏，先用4%的多聚甲醛固定24 h，然后制备成石蜡切片，再采用HE染色及Masson染色，对大鼠肝组织的损伤情况及纤维化程度进行观察。③肝功能指标检测方法：取大鼠下腔静脉血，以肝素抗凝，将血样3000转低温离心30 min后，再按照试剂盒的说明书步骤对血样进行检测，将所得到的检测结果换算为酶活力卡门氏单位。④TGF-β1检测方法：取大鼠下腔静脉血，先以肝素抗凝，按照TGF-β1 ELISA试剂盒的检测要求进行酸化活化后，再按说明书的步骤对血样进行检测。⑤CTGF/PDGF检测方法：取大鼠下腔静脉血，先以肝素抗凝，按照CTGF/PDGF ELISA试剂盒的检测要求，取血样以3000转低温离心30 min，再取上清按说明书步骤对血样进行检测。

1.4 统计学方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，图像采用Image J进行半定量分析，数据结果组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 连续给药8周各组大鼠体重变化比较

模型组大鼠体重显著高于空白组，差异有统计学意义（P<0.05）;模型组大鼠体重升高到第4周开始逐渐下降，空白组、普萘洛尔组、实验组体重持续上升，普萘洛尔组的大鼠体重升高最为显著，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.2 各组大鼠肝组织病理切片结果比较

2.2.1 HE染色结果  空白组大鼠的肝组织结构基本正常，细胞排列整齐、结构完整，肝细胞围绕中央静脉呈条索状规律排列;模型组大鼠肝组织出现显著纤维增生和大量条索样改变，部分细胞出现脂肪变性;与模型组大鼠比较，普萘洛尔组、实验组大鼠纤维增生改善明显，肝小叶结构完整，未见明显的细胞脂肪变性，病理性肝损伤程度减轻。

2.2.2 Masson染色结果  空白组大鼠肝组织切片可见肝细胞形态正常，肝组织结构完整;模型组大鼠肝组织切片可见肝细胞排序混乱及胶原沉着，肝小叶结构破坏明显，汇管区可见结缔组织增生;与模型组比较，普萘洛尔组、实验组大鼠肝细胞排列比较规整，未见明显的胶原沉积，而且肝小叶结构破坏有不同程度的修复，小叶间隙缩窄，肝纤维化程度降低，仅见少量纤维组织增生。

2.3 各组大鼠血清AST、ALT、TP、ALB、TBIL结果比较

与空白组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、TBIL显著升高（P<0.05），血清TP、ALB显著降低（P<0.05）;与模型组比较，普萘洛尔组、实验组大鼠血清AST、ALT、TBIL显著降低（P<0.05），普萘洛尔组大鼠血清TP、ALB显著升高（P<0.05），实验组大鼠血清ALB显著升高（P<0.05）;与普萘洛尔组比较，实验组大鼠血清AST、TBIL无显著差异（P>0.05），ALT显著增高（P<0.05），TP、ALB显著降低（P<0.05）。见表2、图1。

2.4 各组大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF及门静脉压力结果比较

与空白组比较，模型组大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF含量显著升高（P<0.05）;与模型组比较，普萘洛尔组、实验组大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF显著降低（P<0.05）;与普萘洛尔组比较，实验组大鼠血清TGF-β1、CTGF显著降低（P<0.05），PDGF无显著差异（P>0.05）。

模型组大鼠PVP显著高于空白组（P<0.05）;与模型组比较，普萘洛尔组、实验组大鼠PVP显著降低（P<0.05）;实验组大鼠PVP与普萘洛尔组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

3 讨论

肝硬化门静脉高压症的临床表现主要有乏力纳差，腹胀，甚则胀大如鼓，腹壁静脉显露，肤色苍黄，严重者颈胸部赤丝血缕，皮下紫癜或呕血等，根据本病的症状及体征可归属为中医“积聚”“鼓胀”“黄疸”等疾病范畴。广东省名中医李力强主任中医师认为，本病属本虚标实、虚实夹杂之证，因正气不足，肝气郁结、气机不畅，气滞血瘀、湿浊内蕴，肝、脾、肾功能失调，三焦气化不利，水湿不化，凝聚成痰，导致痰瘀阻络、聚水为胀而发病，治宜活血消癥、健脾益气、疏肝理气，并以《太平圣惠方》[8]鳖甲丸为基础研制了活血消癥益气的中药复方鳖甲消癥丸治疗本病。该中药复方由醋鳖甲、醋三棱、醋莪术、人工麝香、西洋参、炙黄芪、醋白芍、炒白术、茯苓、生大黄、生甘草等组成;醋鳖甲入肝消积、软坚散结，麝香通窍活络、活血消癥，为君药;醋莪术与醋三棱活血行气、消癥止痛，为臣药;西洋参和炙黄芪补益气血、扶益正气，醋白芍柔肝止痛，炒白术和茯苓健脾益气、利水祛湿，共为佐药;生大黄活血化瘀、荡涤湿热，生甘草缓急止痛、调和诸药，共为使药。诸药合用，共奏益气活血、化瘀消癥之功效，标本同治。30余年的临床应用研究表明，活血消癥益气中药复方鳖甲消癥丸对预防肝硬化门静脉高压食管胃静脉破裂出血、抗肝纤维化等有顯著效果[4-5]，能明显改善患者肝区疼痛、黄疸、腹水、蜘珠痣、肝掌、舌边瘀斑、脾肿大等症状;显著降低门静脉压力和食管静脉压力，改善食管静脉曲张，预防食管胃静脉出血;改善肝纤维化，降低肝内血管和门体侧支血管阻力。

本研究结果显示，模型组大鼠体重升高到第4周开始逐渐下降，PVP、血清AST、ALT、TBIL、PDGF、TGF-β1、CTGF水平显著高于空白组（P<0.05），血清TP、ALB显著低于空白组（P<0.05）;病理切片结果显示，模型组大鼠肝细胞排序混乱，部分细胞脂肪变性，肝组织出现明显的纤维增生和大量条索样改变，肝小叶结构破坏明显，汇管区结缔组织增生明显，提示造模成功。非选择性β受体阻滞剂（Nonselec-tive beta blocker，NSBB）普萘洛尔可通过降低门静脉压力，降低肝硬化食管胃静脉曲张患者发生首次及再次出血的风险[9]，对轻度食管、胃底静脉曲张的肝硬化代偿期患者推荐使用NSBB[2]。本研究结果显示，普萘洛尔能够有效降低肝硬化门静脉高压症大鼠门静脉压力、改善肝功能损害，经8周治疗后，病理肝损伤程度减轻，肝组织纤维增生明显改善，肝小叶结构破坏得到修复，肝细胞排列规整，未见大量胶原沉积和细胞脂肪变性，大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF水平显著降低，与以往研究结果一致[10-13]，进一步证实了普萘洛尔治疗肝硬化门静脉高压症的效果。

本研究结果显示，经8周的干预治疗，实验组大鼠体重持续上升，PVP显著低于模型组（P<0.05）;病理性肝损伤程度显著减轻，纤维增生显著改善，肝小叶结构完整，小叶间隙缩窄，肝细胞排列规整，未见细胞脂肪变性和大量胶原沉积，且与普萘洛尔组比较无明显差异。与模型组相比，实验组大鼠血清AST、ALT、TBIL、PDGF、TGF-β1、CTGF显著降低，ALB显著升高（P<0.05）;实验组大鼠PVP、血清AST、TBIL、PDGF与普萘洛尔组比较，差异无统计学意义（P>0.05），且血清TGF-β1、CTGF显著低于普萘洛尔组（P<0.05），提示活血消癥益气方对肝硬化门静脉高压症大鼠门静脉压力、肝纤维化、肝功能均有明显的改善作用，效果与普萘洛尔基本相当。肝纤维化是肝硬化门静脉高压症形成的早期改变，肝星状细胞（HSC）因其存在血管周围并能起收缩作用被认为是肝硬化门静脉高压症血流动力学研究的关键因子[14-15]。PDGF可以激活静止的HSC并使其活化，促使 HSC快速分裂与增殖，同时促使新合成的细胞迁移至相关部位与受体快速结合，并诱导HSC分泌TGF-β1等细胞因子[16-17]。临床研究表明，肝硬化患者血清PDGF水平变化可反映肝功能损伤状况[18]。已有研究认为，TGF-β1是介导肝损伤及纤维化最关键的细胞因子之一，可特异性地诱导成纤维细胞产生CTGF等细胞因子，而CTGF是一种可刺激成纤维细胞增殖和胶原沉积生长的新型细胞因子，在病理情况下其过度表达与肝硬化、肺纤维化、肾纤维化、动脉粥样硬化等许多增生性或纤维化疾病发生发展密切相关;同时，TGF-β1可以促进纤维细胞生成、抑制胶原降解，而且CTGF和TGF-β1还可以通过自分泌或旁分泌机制，加速HSC的活化、增殖及基质的合成。随着肝纤维化程度的加重，CTGF、TGF-β1水平表达逐渐增强[19-20]。本研究结果显示，实验组大鼠血清PDGF、TGF-β1、CTGF水平显著低于模型组（P<0.05），提示活血消癥益气方改善肝硬化门静脉高压症大鼠门静脉压力、肝纤维化、肝功能的作用机制可能是与调控PDGF、TGF-β1、CTGF有关。

综上所述，普萘洛尔组、实验组大鼠PVP及血清AST、ALT、TBIL、PDGF、TGF-β1、CTGF水平显著低于模型组，普萘洛尔组TP、ALB显著高于模型组，病理切片结果显示肝纤维化、肝细胞损伤明显好转，表明普萘洛尔、活血消癥益气均能有效治疗肝硬化门静脉高压症。活血消癥益气中药复方治疗肝硬化门静脉高压症的疗效可能与调控血清PDGF、TGF-β1、CTGF水平有关。

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（收稿日期：2020-07-14）