响应面法优化复合澄清剂澄清山药醋工艺

王美洪，陈善敏，许 洋，蒋和体，*

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715;2.食品科学与工程国家级实验教学示范中心(西南大学)，重庆400715)

山药(Rhizoma dioscoreae)，薯蓣科草本植物，含有皂苷、胆碱、糖蛋白和多种氨基酸，还有抗性淀粉、黄酮、尿囊素等活性保健成分［1－2］，有抗氧化、抗癌活性和调节脂质代谢等药理作用［3］。由于山药资源丰富，淀粉含量高，而且不具备分解纤维素和水解蛋白质的酶系统［4］，其作为一种优良的保健醋发酵原料，既可满足广大消费者需求，也拓宽山药销售市场，减少其在运输过程的腐烂败坏，提高山药的综合利用率。

原料山药在酿造过程糖化不完全的残留物以及杀菌过程不彻底的粘稠产物，在装瓶后会变性或聚集，从而使果醋在自然条件下难以澄清、易二次反浊、失光［5－6］，山药醋的澄清势在必行，以山药为原料进行破碎、打浆、调整成分、发酵，通过添加不同的澄清剂对山药醋进行澄清处理，山药醋中的大分子物质被吸附，进而达到果醋澄清的目的。

陈珍金等［7］利用明胶对液态发酵柿子醋进行澄清，发现明胶添加量为3%－5%时，柿子醋澄清和除涩效果较好。卢维奇等［8］用几丁质－麦饭石复合物澄清保健醋，发现两澄清剂间存在协同作用使醋获得良好澄清效果，且澄清后醋主要理化营养指标并无改变。目前对山药这种兼具药食同源的淀粉物质制作的保健醋产品极少，且对造成其商品价值下降的澄清技术的研究几乎没有。本试验在单一澄清剂基础上，利用响应面模型优化最佳澄清条件，以透光率为参考指标，考察硅藻土和壳聚糖复合澄清的最适条件组合对山药醋的澄清效果，以期为山药醋澄清工艺提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

供试山药 产自河南省商丘市，购于重庆市北碚区天生丽街永辉超市，选用同批次大小均一、无机械损伤和病害的新鲜山药;酵母1383 实验室4℃保藏;巴氏醋杆菌巴氏亚种1.41(Acetobacter pasteurianus subsp.Pasteurianus 1.41) 购于中国微生物菌种保藏管理中心;壳聚糖 广东鹿鸣食业有限公司;硅藻土 河南顺鑫食化生物科技;明胶 河南万邦实业有限公司(以上均为分析纯);果胶酶(2000 U/g)诺维信生物技术有限公司。

UNICO－7200分光光度计 上海巴玖实业有限公司;HWS－26电热恒温水浴锅 上海齐欣科学仪器厂;PHS－3C酸度计 上海雷磁仪器厂;PAL－1手持糖度仪 上海上天精密仪器有限公司;HDL－4台式离心机 常州市鸿科仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 山药醋的发酵工艺流程和操作要点

1.2.1.1 工艺流程 参考文献［9］。

1.2.1.1 操作要点 打浆酶解:将蒸熟后的山药去皮后按料液比1∶4(g∶mL)混合打浆后，等比加入0.15%葡萄糖淀粉酶(酶活50000 IU/g)和α－淀粉酶(酶活100000 IU/g)水浴锅65℃糖化2 h后糖度为22%。

酒精发酵:糖化后的山药浆在450W下微波灭酶2.5 min后调糖度到25%，高压蒸汽灭菌后加入已活化的酵母菌扩培液，经28℃发酵24 h后换发酵栓，再25℃发酵6 d，发酵后测得酒精度13%，残糖量0.35 g/100 mL。

醋酸发酵:山药酒经过滤后，调节酒精度为7%，在121℃、15 min条件下对原酒进行高压蒸汽灭菌后，加入15%活化后的巴氏醋酸杆菌扩培液，在30℃、120 r/min摇床条件下发酵，每隔12 h取样测定酸值，至总酸值增长缓慢停止醋酸发酵。

澄清［10－12］:以澄清剂复配比例、添加量、澄清时间和澄清温度四个因素对山药醋的澄清工艺进行优化，得到品质优良的山药醋。

1.2.2 山药醋澄清条件优化

1.2.2.1 单一澄清剂澄清 分别采用配制成10%的硅藻土、果胶酶、壳聚糖、明胶澄清剂溶液以1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山药醋中混合均匀，于40℃恒温水浴锅中静置60 min，经3000 r/min离心12 min后，取上清液在480 nm处［13］测定透光率，同时做三组平行。

1.2.2.2 复合澄清剂澄清条件优化单因素实验 以单因素结果筛选出两种效果最好的澄清剂做复合试验，分别考察复合澄清剂配比、复合澄清剂总添加量、澄清温度和澄清时间对山药醋澄清效果的影响。

硅藻土与壳聚糖复合澄清剂按混合比5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、2∶3(g∶g)，总添加量3 g/L加入到20 mL山药醋中混合均匀，在40℃下保温60 min，3000 r/min离心12 min后，取上清液在480 nm处测定其透光率，确定复合澄清剂最佳配比。

以复合澄清剂配比1∶1，复合澄清剂总添加量按照1、2、3、4、5、6 g/L加入到20 mL山药醋中混合均匀，在40℃下保温60 min，经离心后，取上清液测定其透光率，确定最适复合澄清剂总添加量。

以复合澄清剂配比1∶1，总添加量3 g/L加入到20 mL山药醋中混合均匀，分别在25、30、35、40、45、50℃静置60 min，离心后取上清液在480 nm处测定其透光率，确定最佳澄清温度。

以复合澄清剂配比1∶1，总添加量3 g/L加入到20 mL山药醋中，混合均匀，在40℃下分别对山药醋保温20、40、60、80、100、120 min。离心后取上清液测定其透光率，确定最佳澄清时间。

表1 中心组合试验设计因素与水平Table 1 Range and corresponding levels of independent variables

1.2.3 响应面优化试验 根据单因素实验结果，以澄清温度(A)、复合澄清剂配比(B)、澄清时间(C)和复合澄清剂添加量(D)为自变量，山药醋透光率为响应值(Y)，进行Box－Behnken中心组合试验。响应面试验因素见表1。

1.2.4 理化指标检测 透光率:可见分光光度法;可溶性固形物:采用手持式糖度计测定;残糖:参照GB/T 5009.7－2008《食品中还原糖的测定》;总酸:参照GB/T 12456－2008《食品中总酸的测定》;氨基酸态氮:参照GB/T 12143－2008《饮料通用分析方法》。

1.3 数据处理

本实验数据均为3次重复试验的平均值±标准差，运用Excel 2016、GraphPad prism 8和Designexpert 8.06软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同澄清剂对山药醋澄清效果影响 据透光率指标分析，四种澄清剂均对山药醋澄清有效果，随澄清剂浓度增加，透光率逐渐增大，当硅藻土、壳聚糖和明胶添加量分别为4、5、4 g/L时，透光率分别为80.1%、78.3%和77.6%，对醋体澄清效果较好;当果胶酶添加量为2 g/L时，山药醋透光率达到最大值75.4%，较前三种澄清剂效果略差，而过多的澄清剂则会悬浮于醋体中让透光率不增反减［14－15］。虽然壳聚糖和明胶对提高山药醋澄清度并无显著差别，但实验发现，经明胶澄清后的山药醋略带异味，这与饶炎炎等［16］发现明胶添加过多会使果汁变色变味一致。最终选择硅藻土和壳聚糖作为复合澄清剂。

图1 不同澄清剂对山药醋澄清效果影响Fig.1 Effects of different clarifiers on clarification effect of yam vinegar

2.1.2 复合澄清剂对山药醋澄清效果影响的单因素实验结果 不同复合澄清剂配比对澄清效果有较大影响。当澄清剂配比为2∶1时，山药醋透光率为91.1%，说明适合的澄清剂配比对澄清效果有增效作用;随着配比的增大，澄清剂间不同电荷浑浊物的互补效果被破坏［17］，透光率也随之下降，因此选择澄清剂配比为2∶1。

随复合澄清剂添加量的增加，醋体中的小分子物质絮凝，透光率也相应增大，当复合澄清剂添加量为4 g/L时，透光率达到90.6%，此后澄清剂吸附能力到饱和，胶体物质被充分沉淀［20－22］，过量澄清剂悬浮于醋体而导致浑浊，因此选择复合澄清剂添加量为4 g/L。

山药醋透光度随温度逐渐增大，当澄清温度为35℃时，透光率达最大值91.6%，说明适宜温度既促进硅藻土多孔结构对醋体中色素、酵母等悬浮物的吸附作用，也增强了硅藻土和壳聚糖之间的相互作用，形成稳定的热力学体系［18－19］，而过高温度则会影响醋中沉降颗粒物质的稳定性，从而使醋体浑浊，根据试验结果选择澄清温度为35℃。

图2 单因素变量对山药醋澄清效果的影响Fig.2 Effects of single factor variable on clarification effect of yam vinegar

表2 山药醋响应面试验结果Table 2 Response surface test results of yam vinegar

表3 回归模型显著性结果Table 3 Significance test for regression model

澄清时间在20～60 min时，透率光从80.5%增至87.8%，增幅明显，此时澄清剂与山药醋中与相应物质发生静电、沉降、分解等作用［23］，加速了醋中色素的吸附和酵母、蛋白质等悬浮颗粒的沉淀，此后透光率稳定在90.2%左右，说明醋体中浑浊物质基本被凝聚沉降，醋体得以澄清。结合实际生产中生产成本及能耗等因素，最终选择澄清时间为80 min左右。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面优化复合澄清条件 为确定澄清工艺的最佳条件，本试验在单因素实验基础上，利用响应面法优化复合澄清剂对山药醋的澄清效果，研究自变量及其交互作用对山药醋澄清效果的影响，确定最佳澄清工艺参数。

用Design Expert 8.06软件对表2的试验数据进行回归拟合［24－25］，获得山药醋透光率的数学模型的二次多项回归方程:

Y=95.56+1.29A+0.88B+1.71C－1.13D－0.20AB+0.15AC－0.85BC+0.45BD+0.53CD－1.32A2－1635B2－2.04C2－1.63D2

为了检验方程的有效性，对山药醋透光率的模拟方程进行方差分析，结果见表3。

图3 各因素交互作用对透光率影响的响应面Fig.3 Response surface of interaction of various factors on transmittance

由表3可知，模型极显著，失拟项不显著，模型决定系数R2=0.9859，说明回归方程有较高拟合度和相关性，模型预测值能较好地反映实际值［26］，可以对复合澄清剂优化澄清山药醋的条件进行分析和预测。模拟项的A、B、C、D、AD、BC、A2、B2、C2、D2达到极显著水平(P＜0.01)，BD、CD达到显著水平(P＜0.05)。AB、AC对响应值均无显著影响。各因素透光率的影响顺序分别是:澄清时间＞澄清温度＞澄清剂添加量＞复合澄清剂配比(硅藻土∶壳聚糖)。

2.2.2 因素交互作用分析 交互作用分析中等高线图能够直接反映各因素对响应值的影响及各因素间相互作用的强弱，各因素交互作用对透光率的影响见图3。

由图3可得，响应面均向下开口且曲面较陡，透光率随各因素的增大呈现先增加后减小的趋势，澄清温度和澄清时间、澄清温度和复合澄清剂配比的交互作用响应面图等高线呈圆形，说明其交互作用不显著;而澄清时间和澄清剂添加量、复合澄清剂配比和添加剂添加量、复合澄清剂配比和澄清时间、澄清温度和澄清剂添加量的响应面图等高线呈椭圆形，说明其交互作用对透光率的影响较显著，这与表3中结果相符合。

2.2.3 山药醋最佳澄清效果的条件验证试验 采用Design－Expert 8.06软件对数据进行响应面分析，得出最佳澄清条件:温度36.38℃，复合澄清剂配比硅藻土∶壳聚糖为2.33∶1时，澄清时间83.01 min，复合澄清剂添加量3.75 g/L，此条件下山药醋透光率预测值96.11%，考虑实践操作简便性并检验其合理性，取硅藻土与壳聚糖配比5∶2(g∶g)、复合澄清剂添加量}澄清温度36.5℃、澄清时间83 min下进行验证试验，重复三次取均值，得到山药醋透光率为95.8%，基本接近预测值。证明该模型优化复合澄清剂澄清山药醋的条件的可行性和有效性。

2.3 山药醋澄清效果及品质评价

选择硅藻土和壳聚糖这两种澄清剂，分别在最佳条件下对山药醋进行单一和复合处理，测定其基本理化指标。由表4可知，单一澄清剂中硅藻土对山药醋的澄清效果最好，透光率高达80.1%，同时能较好地保持山药醋中可溶性固形物、总酸和氨基酸态氮的含量，壳聚糖的澄清效果仅次于硅藻土，透光率达到78.3%，但其对氨基酸态氮的保存率低于硅藻土，可能原因是壳聚糖和蛋白质之间存在氢键形式的静电引力，其相互作用会加速蛋白质和游离氨基酸的吸附［27］。复合澄清剂的澄清效果明显优于其他单一澄清剂，透光率达到95.8%，澄清后醋体澄浅黄棕，清透有光泽，带有浓郁醋香，口感酸而不涩无杂物，同时能够较好地保存山药醋的品质，因此，复合澄清是山药醋的最佳澄清方法。

表4 山药醋的理化指标Table 4 Physical and chemical indexes of yam vinegar

3 结论

山药醋中含有蛋白质、酵母、色素、单宁等大分子物质，这些物质会造成醋体浑浊、不稳定［28－30］。通过不同的澄清剂处理山药醋，比较其透光率以及各项指标，可知复合澄清剂处理山药醋的澄清效果明显优于单一澄清剂，最佳澄清条件为:硅藻土与壳聚糖配比5∶2，澄清温度为36.5℃，澄清时间为83 min，复合澄清剂添加量4 g/L。在此条件下，经验证性试验得出山药醋澄清的透光率为最大值，达到95.8%，比原醋升高了27%，同时对山药醋其他各项指标均无明显影响，氨基酸态氮0.27 g/100 mL，总酸5.29 g/100 mL，可溶性固形物8.74°Bx，处理后的山药醋呈浅黄棕，色泽均匀透亮，醋味酸感柔和。