硫酸右旋糖苷通过下调HMGA2/β-catenin影响人胃癌细胞转移的研究

李梦琪，焦龙杏，郭嘉欣，尚 静，徐远义，黄允宁

（1.宁夏医科大学基础医学院病理学系，银川 750004；2.宁夏回族自治区人民医院胃肠外科，银川 750001）

胃癌是全球最常诊断的癌症之一[1]。转移是胃癌高病死率的主要原因，而肿瘤细胞发生上皮间充质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT）是肿瘤转移的分子机制之一[2]。目前胃癌的治疗以手术和化疗为主[3]，但效果并不理想。因此，开发有效的抗肿瘤药物抑制人胃癌细胞的侵袭、迁移和EMT对胃癌的治疗具有重要意义。硫酸右旋糖苷（dextran sulfate，DS）是一种带有硫酸根的多糖，具有腹腔吸收缓慢，作用时间持久的特点。课题组前期研究发现该分子质量的DS可以抑制人胃癌细胞的增殖和粘附，并减少腹腔种植转移[4]。然而，其发挥作用的分子机制还需进一步探究。高迁移率族蛋白AT2（HMGA2）是一种结构转录因子，属于高迁移率族蛋白家族成员之一。据The Human Protein Atlas数据库分析HMGA2在肿瘤中高表达，并且在胃癌患者组织中呈现高表达状态。有文献[5-6]研究显示，前列腺癌、食管鳞状细胞癌中HMGA2与肿瘤细胞发生EMT密切相关。β-catenin是Wnt信号通路的关键因子，研究表明，在视网膜母细胞瘤中microRNA-98通过介导Wnt/β-catenin途径靶向HMGA2抑制视网膜细胞瘤的迁移和侵袭[7]。因此，探究以HMGA2/β-catenin为靶点的研究，对胃癌的治疗具有积极的意义。本研究通过体内外实验，探讨DS是否可以影响人胃癌细胞HMGA2/βcatenin的表达并抑制人胃癌细胞侵袭、迁移和EMT。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 人胃癌标本 收集宁夏回族自治区人民医院2018年10月至2019年10月经手术切除、术后病理确诊为胃腺癌的组织标本24例，所有患者术前均未接受放疗及化学药物治疗。

1.1.2 细胞与动物 人胃癌细胞株HGC-27，由哈尔滨医科大学肝脾外科实验室蒋寒冰赠予。BALB/c裸鼠购自北京维通利华实验动物科技有限公司［动物牌照号SCXX（Jing）2006-0009］，5～6周龄，雄性，体质量18～22 g。在宁夏医科大学实验动物中心SPF条件下饲养，实验步骤已通过宁夏医科大学实验动物福利伦理审查委员会批准。1.1.3药物与试剂DS分子质量500000 Da，购自美国Sigma公司。HMGA2、β-catenin、E-cad单克隆一抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；N-cad一抗购自中国博奥森公司；β-actin抗体、山羊抗兔和鼠二抗均购自中杉金桥技术有限公司；胎牛血清购自Bioind公司；RPMI-1640培养基购自美国Hyclone公司；兔二步法检测试剂盒（PV-9001）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、ECL化学发光试剂盒购自江苏凯基生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；电泳转膜系统购自美国Bio-Rad公司；反转录及实时荧光定量（RT-qPCR）试剂购自TaKaRa公司；青链霉素混合液购自北京索莱宝公司；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 细胞常规培养于含10% FBS与1%青链霉素混合液的RPMI-1640完全培养基，置于37℃、5% CO2培养箱内培养；取对数生长期的细胞进行实验。

1.2.2 免疫组织化学 免疫组化染色采用二步法。标本经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片烤干，二甲苯及梯度浓度的乙醇溶液脱蜡、脱水、抗原修复，封闭，一抗4℃孵育过夜，二抗孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，分化，脱水，封片。显微镜观察阳性染色分布特点，选定具有代表性的5个视野拍照。使用Image-Pro Plus 6.0软件分析图像，平均光密度值=阳性染色组织积分光密度（IOD）/面积（area）。

1.2.3 划痕愈合实验 将HGC-27细胞接种于6孔板，待细胞铺满孔底，用无菌移液器枪头在6孔板底部进行“一”字形划痕，PBS洗3次后对照组加入无血清培养基，DS组加入含0.3% DS的无血清培养基，显微镜下观察0、24 h后细胞的愈合情况并拍照。沿划痕边缘取3处测量划痕宽度，取平均值。划痕愈合率（%）=（0 h划痕宽度－观察时间划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。

1.2.4 Transwell实验 采用预铺Matrigel基质胶的8μm规格的聚碳酸酯滤膜培养小室，进行Transwell侵袭实验；采用同样规格未铺基质胶的小室进行Transwell迁移实验。将HGC-27细胞制成1×105/mL密度的细胞悬液，接种200μL细胞悬液到Transwell小室的上室，下室加入500μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液，每组设3个复孔。在37℃、5% CO2条件下培养24 h后，用棉签轻擦拭上室，4%多聚甲醛固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色10 min，显微镜下随机计数5个视野的细胞数，取平均数为每组穿过小室的细胞数。

1.2.5 Western blot将0、12和24 h收集的细胞加入裂解液冰上裂解，用BCA蛋白定量试剂盒定量。等量蛋白（50μg）上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（6%～15%），常规湿转法进行转膜，10%脱脂牛奶室温封闭1.5 h，对应抗体4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜，二抗孵育室温2 h，滴入ECL化学发光试剂，AmershamImager 600仪器曝光。应用ImageJ软件测量各条带的灰度值，以β-actin为内参，用各时间点目的蛋白与内参蛋白表达灰度值的比值来表示相对蛋白量，用SPSS 23.0统计软件进行各时间点比较，Graphpadprism 8.0绘制柱状图。

1.2.6 实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）使用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA浓度和纯度，按照TaKaRa逆转录试剂盒（RR047）说明将RNA逆转录成cDNA，然后用TBGreen法（TaKaRa，RR820）以GAPDH为内参进行RTqPCR，引物序列见表1。每个样本设3个复孔，记录CT值，用2-△△CT方法计算基因的表达水平。

表1 RT-qPCR引物序列

1.2.7 构建裸鼠腹腔种植转移模型BALB/c裸鼠在宁夏医科大学实验动物中心SPF条件下饲养，可自由获取无菌食品和水。24只随机分为对照组、DS组（0.3% DS干预），每组12只，调整HGC-27细胞浓度为1×107个/mL，取0.2 mL细胞悬液注射于裸鼠腹腔。整个实验过程严格按照无菌操作进行。术后第14天，采用脱颈法处死裸鼠，然后观察腹腔内特别是网膜内肿瘤结节的数量、大小、颜色。收集大网膜组织经焦碳酸二乙酯（DEPC）水预灭菌处理，-80℃冷冻，用于后续实验。

1.3 统计学方法

采用SPSS 23.0和Graphpad prism 8.0对数据进行统计学分析和作图。各实验独立重复3次，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较采用两独立样本t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HMGA2、β-catenin、N-cad和E-cad在人胃癌组织中的表达

人胃癌组织免疫组化结果显示，癌组织中HMGA2主要呈棕黄色分布于细胞核；β-catenin、N-cad在胃癌细胞胞浆呈棕黄色分布，而在癌旁正常组织中染色均弱于癌组织；E-cad呈棕黄色线性分布于癌旁正常组织的细胞膜，而癌组织染色减少。癌组织中HMGA2、β-catenin、N-cad表达均高于癌旁正常组织，而E-cad表达则低于正常组织（P均＜0.05）。见图1。

图1 HMGA2、β-catenin、E-cad和N-cad在人胃癌组织中的表达

2.2 DS抑制人胃癌细胞的划痕愈合能力

HGC-27细胞划痕实验结果显示，与对照组相比，DS干预24 h后HGC-27细胞的划痕愈合能力受到抑制（P＜0.01），提示DS可以抑制胃癌细胞的迁移能力。见图2。

图2 划痕愈合实验观察0和24 h光镜下划痕愈合能力

2.3 DS抑制人胃癌细胞HGC-27的迁移和侵袭

Transwell结果显示，与对照组相比，DS干预24 h后HGC-27细胞迁移数量减少（P＜0.01），同样在DS干预24 h后HGC-27细胞侵袭数量较对照组减少（P＜0.01），表明DS可以抑制HGC-27细胞的迁移和侵袭能力。见图3A、B。

图3 DS抑制人胃癌细胞HGC-27的迁移和侵袭

2.4 Western blot与RT-qPCR检测人胃癌细胞HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表达

在DS干预人胃癌细胞第0 h DS组HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad蛋白表达与对照组相比差异均无统计学意义（P均＞0.05），而12、24 h DS组HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白水平均低于对照组（P均＜0.05）；E-cad的表达在12 h差异无统计学意义，但在24 h DS组蛋白表达高于对照组（P＜0.01）。见图4A、B。DS干预24 h后提取总RNA进行RT-qPCR分析，与对照组相比，DS可以减少HMGA2、β-catenin、N-cad的表达（P＜0.05），而增加E-cad的表达（P＜0.01）。见图4C。

图4 DS干预HGC-27细胞后各因子蛋白和mRNA的表达

2.5 建立裸鼠腹腔种植转移模型

通过腹腔种植转移模型可观察到裸鼠腹腔转移肿瘤结节呈瓷白色，质地坚硬；对照组肿瘤结节数量明显多于DS组，且肿瘤结节体积较DS组大。见图5。

图5 腹腔种植转移模型观察腹腔转移瘤数量

2.6 Western blot检测裸鼠大网膜组织HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表达

在裸鼠组织中DS干预后HMGA2、β-catenin、N-cad蛋白表达均低于对照组（P＜0.01），而Ecad在DS干预后表达高于对照组（P＜0.01）。见图6A、B。

图6 目的因子在裸鼠腹腔种植转移瘤模型大网膜中蛋白表达水平

3 讨论

胃癌是一种高患病率、高病死率的疾病。鉴于胃癌转移是胃癌高病死率的主要原因之一，所以研究有效的抗肿瘤药物抑制肿瘤转移提高患者存活率具有重要意义。

DS属于右旋糖苷的衍生物，其生物活性与其分子质量有关。有研究[8]表明，分子质量在1000 Da到10000 Da的DS可以抑制HIV病毒的活性。而分子质量在10000 Da到40000 Da时，DS可通过调节细胞表面的电荷减少细胞聚集，提高干细胞产量，并可以通过减少透明质酸酶的表达抑制乳腺癌细胞的迁移能力[9-10]。本课题组选用的DS分子质量为500000 Da，经前期研究发现该分子质量的DS可以抑制人胃癌细胞的增殖和粘附，并减少腹腔种植转移[4]。然而，其发挥作用的分子机制还需进一步探究。

HMGA2是一种结构转录因子，属于HMGA蛋白家族。HMGA蛋白的特征是含有3个DNA结合区域，称为AT-hooks和一个酸性羧基末端，其可以通过与DNA中AT富集区域结合而改变DNA构象调控基因表达，从而影响包括细胞生长、增殖、分化和死亡在内的一系列生物过程[11]。HMGA2在胚胎期以及不成熟组织中高度表达[12]，但在正常的成年组织中不表达或低表达，而研究显示在视网膜母细胞瘤、肺癌、肝癌、结肠癌[7，13-15]中HMGA2均有过表达。β-catenin是Wnt信号通路的关键因子，当上游因子激活Wnt信号通路后胞质内β-catenin不能正常降解而富集转运入细胞核，在胞核内结合转录因子调节下游靶基因的表达[16]，然而Wnt信号通路是EMT的关键通路之一。HMGA2与Wnt信号通路关系密切，Li等[7]研究发现microRNA-98通过介导Wnt/β-catenin途径靶向HMGA2抑制视网膜细胞瘤的迁移和侵袭；Dai等[17]研究发现miR-150-5p通过靶向HMGA2调节Wnt/β-catenin信号通路来抑制非小细胞肺癌的转移和复发。因此，在胃癌中HMGA2/β-cantenin可能成为治疗靶点。

EMT在胚胎形成和发育中发挥重要的作用[18]，而在肿瘤发展过程中EMT作为关键步骤参与肿瘤的转移[19]。肿瘤在体内转移过程分为：肿瘤细胞从肿瘤原发灶分离并发生迁移，穿透基底膜，进入血液或淋巴管，从血液或淋巴管流出，最后形成转移性结节[20]。然而，EMT在肿瘤转移起始阶段，通过增强肿瘤细胞的流动性、侵袭性和对凋亡刺激的抵抗力促使肿瘤细胞离开原发灶开始寻找原发灶以外适合生存的器官，即肿瘤发生转移[21]。因此，EMT被认为是肿瘤发生的关键标志，而研究通过抑制EMT治疗肿瘤可以作为肿瘤治疗的新策略[22]。肿瘤细胞发生EMT的同时会伴随细胞内的分子改变，例如，上皮标记物（E-cad）表达减少，间质标记物（N-cad、vimentin）表达增加，这些标志性的分子改变会有助于判断EMT发生与否。Liu等[23]研究证明Tiam1通过激活Wnt/β-catenin信号通路诱导细胞发生EMT，促进甲状腺癌转移。

本研究对24例胃癌标本进行免疫组化分析发现：癌组织中HMGA2、β-cantenin、N-cad表达明显高于癌旁正常组织；而癌组织中E-cad表达明显弱于正常组织。推测在胃癌中HMGA2、Wnt信号通路与EMT之间是否存在联系，DS是否可以影响这一过程。为验证猜想进行了体外实验的研究，划痕愈合实验结果显示DS干预24 h后细胞的迁移能力减弱，表明DS可抑制人胃癌细胞的横向迁移能力。Transwell实验显示DS干预24 h后发生侵袭和迁移的细胞数量明显减少，证明DS可抑制人胃癌细胞的迁移和侵袭能力。为进一步探讨DS作用的分子机制，选取HGC-27细胞进行Western blot和RT-qPCR实验，结果显示DS干预24 h后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表达与对照组相比明显减弱，而E-cad表达显著增强。以上体外研究结果显示：DS可以抑制人胃癌细胞的侵袭和迁移，并使HMGA2、β-cantenin、N-cad表达减弱，而E-cad表达增强。为了继续探索DS的作用机制，本研究进行体内实验：在已建立裸鼠腹腔种植转移模型中可以观察到对照组裸鼠腹腔转移肿瘤结节呈瓷白色，质地坚硬；并且对照组肿瘤结节数量多于DS组，且肿瘤结节体积较DS组大。取DS组与对照组裸鼠的大网膜组织进行Western blot检测HMGA2、β-catenin、E-cad、N-cad的表达情况，结果表明DS组经过DS干预后HMGA2、β-cantenin、N-cad的表达明显受到抑制，但是DS促进了E-cad的表达，此结果与体外Western blot实验结果一致。本研究发现DS可以抑制HMGA2/β-catenin，并且影响人胃癌细胞侵袭、迁移和EMT，提示HMGA2/β-catenin可能是DS发挥抑制肿瘤转移作用的新靶点。

综上所述，DS可以下调HMGA2/β-cantenin信号抑制人胃癌细胞侵袭、迁移和EMT。其中的具体机制还需要进一步验证，同时本研究为后续探究DS抑制肿瘤转移的分子机制提供新的思路。