NOD2-/-小鼠H37Ra感染后对肺组织Toll样受体表达的影响

刘俊彤，汤业珍，彭 茜，韩怀钦，梁锦屏，2

（1.宁夏医科大学基础医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院临床病原生物重点实验室，银川 750004）

结核病（tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染引起的一种慢性传染病，估算全球约有17亿人感染结核分枝杆菌，我国每年新发病例约为130万，居全球第二位[1]。结核病耐药菌株的高发病率[2]以及MTB与HIV共感染是目前面对的棘手问题[3]。因此，需要寻求新型有效的抗MTB治疗方法。结核分枝杆菌感染机体后，机体能够通过各种模式识别受体识别结核分枝杆菌组分，从而发挥抗感染免疫作用[4]。其中Toll样受体（toll like receptor，TLR）2、TLR4和核苷酸结合寡聚化结构域蛋白2（nucleotide-binding oligomerization domain 2，NOD2）分别是细胞膜上和细胞内的模式识别受体，在感染中发挥重要作用[5-7]。

机体的免疫调控是复杂的网络体系，各信号通路之间往往存在相互作用与联系[8]。NOD2主要表达于单核细胞和巨噬细胞，除了产生炎性细胞因子，还能够通过NF-κB和MAPK途径增加趋化因子的产生，从而使免疫细胞在机体抗感染中发挥重要作用[9]。当微生物突破机体的皮肤、黏膜等物理屏障时，Toll样受体可识别病原体并刺激机体产生免疫应答。在菌体的刺激下，不同的TLRs将信号传递给下游分子，从而激活多种信号通路，其中之一就是通过激活NF-κB进而表达炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α等[10]。研究发现，除了TLR3外，其余TLRs是通过活化髓样分化因子88（MyD88）激活下游NF-κB和MAPK途径，而NOD1、NOD2是通过募集活化RIP2蛋白激活NF-κB[9]，因此NOD2和TLRs在激活下游NF-κB途径可能存在相互作用。目前研究中对肺组织NOD2与TLRs信号通路在结核分枝杆菌感染时存在怎样的调控关系仍不清楚[11]。本文旨在探讨NOD2-/-小鼠感染结核分枝杆菌H37Ra后Toll样受体TLR2、TLR4的变化，为丰富结核分枝杆菌致病机理及寻求临床免疫治疗或设计新型疫苗提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物NOD2-/-小鼠由美国国家医学院院士耶鲁大学医学院免疫学系Richard A.Flavell教授馈赠于宁夏医科大学梁锦屏副教授，宁夏医科大学医学实验动物中心SPF条件下饲养繁殖，设立野生型小鼠C57BL/6为对照（WT）组。小鼠6～8周龄雄鼠，18～22 g，每只小鼠均剪取指甲提取DNA采用琼脂糖凝胶电泳重复鉴定，确认无误后随机分组。分笼前饲养3 d，自由摄取食水。

1.1.2 试剂TLR2、TLR4等兔抗鼠抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司；全蛋白提取试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ECL（Enhanced chemiluminescent）化学发光液（Amersham，美国）；RNA提取试剂盒（天根生化科技公司）；反转录试剂盒（TaKaRa，日本）；ELISA试剂盒（酶联生物科技有限公司）；PCR引物由上海生工设计合成。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型构建NOD2敲除组和野生型组随机分为生理盐水组和H37Ra组，即生理盐水滴注野生型小鼠组（wn）、H37Ra滴注野生型小鼠组（wh）、生理盐水滴注NOD2-/-小鼠组（nn）、H37Ra滴注NOD2-/-小鼠组（nh），共4组，每组6只。腹腔注射水合氯醛麻醉小鼠，采用非暴露式气管滴注30μL H37Ra菌液（1×106CFU），垂直悬挂1 min使菌液在肺脏内均匀分布，建立感染模型小鼠，阴性对照组（wn、nn组）同法滴注30μL生理盐水。造模1周后各组处死6只小鼠取材，8周后取各组剩余小鼠组织。

1.2.2 观察小鼠肺组织病理学改变 实验结束后，无菌取肺脏，4%的多聚甲醛固定48 h，进行脱水、包埋、切片并HE和抗酸染色。镜检观察小鼠感染情况及肺脏病变程度。

1.2.3 肺组织中TLR2、TLR4基因表达情况 取小鼠肺组织，无菌无酶环境下提总RNA，逆转录后，按照qPCR试剂盒说明书进行PCR反应，实验所用引物见表1。

表1 PCR实验所用引物

1.2.4 Western blot检测细胞中TLR2、TLR4蛋白的表达 取小鼠肺组织，提总蛋白，常规电泳、转膜，5%脱脂奶粉37℃，摇床孵育2 h。特异性抗体孵育（一抗稀释比为1∶1000），4℃水平摇床过夜。次日1∶7000稀释山羊抗兔二抗室温孵育2 h，ECL底物显色，蛋白成像系统曝光检测。

1.3 统计学方法

数据采用SPSS 16.0软件进行统计学分析。实验数据以均数±标准差（±s）表示，两组均数比较采用t检验，多组均数比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NOD2-/-小鼠、野生型小鼠基因型鉴定

结果表明，1、2号小鼠为NOD2-/-小鼠；3、4号小鼠为野生型小鼠。见图1。

图1 PCR琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型

2.2 结核分枝杆菌H37Ra感染对NOD2-/-小鼠肺组织结构的影响

1周WT小鼠感染后肺组织中可见炎性细胞浸润、多数肺泡腔消失，NOD2-/-小鼠感染组可见肺组织中有弥漫性炎性细胞浸润，肺组织实变，多数肺泡腔消失，高倍镜下可见上皮样细胞、单核细胞和淋巴细胞为主的肉芽肿样病变。8周各组与1周组病理特征相似，无明显差异。见图2。

图2 小鼠肺组织病理切片HE染色（×200）

2.3 观察结核分枝杆菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺组织中结核分枝杆菌菌体

1周小鼠抗酸染色后，NOD2-/-与WT感染组见较少的结核病变结节，生理盐水组未出现结核分枝杆菌菌体；8周NOD2-/-小鼠感染组肺组织内出现MTB聚集成团，NOD2-/-小鼠感染MTB后其炎症病理较WT小鼠感染组更严重。见图3。

图3 小鼠肺脏抗酸染色结果（×1000）

2.4 NOD2-/-小鼠感染结核分枝杆菌H37Ra后对TLR2、TLR4基因表达的影响

NOD2-/-小鼠与WT小鼠经气管滴入生理盐水、H37Ra，提取肺组织RNA，利用RT-qPCR技术检测两组TLR2、TLR4基因的表达。8周NOD2-/-小鼠H37Ra感染组TLR2、TLR4表达均高于WT小鼠H37Ra感染组（P均<0.001）。1周与8周WT小鼠组间差异无统计学意义（P＞0.05），8周NOD2-/-小鼠感染组TLR2、TLR4 mRNA均高于1周NOD2-/-小鼠感染组（P均<0.001）。见图4。

图4 NOD2-/-与WT小鼠肺组织中TLR2、TLR4基因表达

2.5 结核分枝杆菌H37Ra感染NOD2-/-小鼠后肺组织中TLR2、TLR4蛋白表达量

经Western blot对两组小鼠肺组织中TLR2、TLR4蛋白表达情况进行测定。结果显示，1周组间差异无统计学意义（P>0.05），8周NOD2-/-小鼠感染组TLR4、TLR2蛋白表达量比WT小鼠感染组升高（P<0.05），相比于NOD2-/-小鼠生理盐水组，H37Ra感染组TLR2和TLR4蛋白活化增加（P<0.01）。8周WT小鼠H37Ra感染组高于WT小鼠生理盐水组（P<0.01）。见图5。

3 讨论

TB的防治是一项长期而艰巨的工作，宁夏地区作为偏远地区甚至有增加的趋势[12]。抗结核药物不但有药物毒副作用，而且有耐药甚至耐多药的MTB产生，近年来出现结核病和艾滋病的双重感染也是结核病防治的难题，因此目前迫切需要寻找更多抗结核的方法[13]。

H37Ra菌株比H37Rv菌株毒力弱，相比卡介苗（BCG）更接近结核分枝杆菌H37Rv株的结构，免疫原性更高，作为动物感染模型菌株更合适，能为设计新型疫苗提供基础研究[14-15]。TLR2/4可通过MyD88依赖途径，激活MyD88及相应的下游效应因子来磷酸化NF-κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB），从而活化NF-κB，启动相应的基因转录发挥免疫作用。有研究发现，NOD2缺陷的小鼠控制结核分枝杆菌的能力大大下降[16]，这说明NOD2可能在天然抗结核免疫中也发挥着至关重要的作用。NOD2与配体结合后，诱发一系列炎性因子的产生，从而起到抗感染免疫作用。研究表明，NF-κB可能是NOD受体和TLR在天然免疫中起协同作用的信号通路基础[17]。虽然已清楚NOD2和TLR2活化后可激活NF-κB和AP-1信号通路，但是这两个信号通路之间是否能相互影响，在抗感染时是否对彼此有调控作用还不清楚[18]。在课题组前期研究中发现，TLRs的下游信号因子MyD88缺失时，BCG感染小鼠的NOD2受体可补充发挥免疫作用[19]。

图5 NOD2-/-与WT小鼠不同处理后肺组织TLR2、TLR4蛋白表达

本实验利用NOD2-/-小鼠模型，观察在NOD2缺失的情况下TLR的表达，探讨NOD样受体（NOD-like receptor，NLR）和TLR相互调控，共同抗菌的机制。抗酸结果显示，H37Ra感染小鼠1周后出现少量结核分枝杆菌菌体，而对照组未出现，8周差异更显著，且NOD2缺陷小鼠感染组相对于野生小鼠组结核分枝杆菌菌体普遍增多，H37Ra可以有效感染小鼠。病理结果表明，1周和8周两种小鼠感染组肺纹理增粗，间质少量充血，炎性细胞浸润增多，但肺组织未见典型的干酪样结核性坏死。这与张爱霞等[20]和夏长胜[21]的研究结果不一致，认为感染7 d后小鼠肺脏组织纹理清晰，间质正常，未见明显炎症性损伤，分析是由于造模方式不同，上述研究采用尾静脉注射；而Lai等[22]认为在肺部感染减毒结核分枝杆菌（MTB H37Ra）的早期阶段，肺部感染水平以对数方式增加，直至C57BL/6小鼠感染后第14天和第21天，这与本实验H37Ra感染小鼠8周抗酸结果一致。提取小鼠肺组织的RNA与蛋白，检测TLR2和TLR4的表达，更准确地体现H37Ra感染的NOD2-/-小鼠肺组织中TLR2、TLR4蛋白的作用。本研究发现H37Ra感染小鼠1周TLR2和TLR4蛋白的表达差异无统计学意义，这与基因检测结果一致。处理8周WT小鼠相比于NS组，H37Ra感染组TLR2和TLR4的表达上升，这与Li等[23]的研究结果一致；NOD2-/-小鼠感染H37Ra后TLR2、TLR4蛋白表达较野生型小鼠升高。本研究结果表明，NOD2基因缺失时，H37Ra感染后的小鼠TLR2、TLR4基因表达升高，补充发挥抗感染免疫作用。有研究发现，虽然NOD2激活NFκB通路，但它抑制TLRs介导的NF-κB激活，因此NOD2缺失降低了这种抑制作用，使NF-κB增加[24]，而Wu等[25-26]认为一些炎症因子或者NF-κB的表达与TLR2/TLR4之间存在正反馈调节，因此本课题组将继续进行后续通路的研究。

在其他疾病的研究中，已经对这两个信号的关系有一些定论。Khan等[9]研究表明NOD2和TLR4在激活树突状细胞（DC）活性方面表现出协同作用。因此，同时激活NOD2和TLR4可能具有显著的免疫治疗潜力，可增强DC的功能，提高对病原体的免疫力。Khan等[27]认为NOD-2L和TLR-4L与减少剂量的异烟肼相结合，降低了肺部的MTB，这种模式识别受体和TB药物的辅助治疗可能具有足够的潜力来减少结核病患者的治疗剂量和持续时间，并且为结核病治疗开辟了新的途径，包括免疫疗法。而NOD2与TLR4的协同作用导致与疾病相关的大脑核团活化增加，从而加强疾病和大脑对外周免疫刺激的反应，NLR和TLR在免疫细胞水平上的已知相互作用延伸到影响大脑功能和行为的相互作用[28]。最新数据表明NOD2基因沉默在软骨细胞中29 kDa氨基端纤维连接蛋白片段（29 kDa Fn-f）与TLR2表达下降，显示NOD2参与29 kDa Fn-f诱导的TLR2表达[29]。但是关于TLR4、TLR2和NOD2在结核病中的抗菌机制还不完善，因此本研究具有创新性和必要性，课题组后续将继续采用NOD2与TLR4激动剂处理小鼠和相关免疫细胞进行研究。