鞘氨醇-1-磷酸干预对小鼠玻璃化冻融卵巢移植后凋亡的影响

秦 天，田 媛，杨延周，张淑雅，王燕蓉，裴秀英，3

（1.宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室，银川 750004；2.宁夏医科大学基础医学院生物化学与分子生物学学系，银川 750004；3.宁夏回族自治区生殖与遗传重点实验室，银川 750004）

随着癌症诊疗技术的发展，癌症患者的存活率有了较大的提高。而恶性肿瘤也呈现出低龄化趋势，约4%的女性恶性肿瘤确诊时不到35岁，大约75%的年轻女性癌症患者未来仍有生育愿望[1]。然而，包括化疗和放疗在内的癌症治疗可能会损害癌症幸存者的卵巢功能和未来的生育能力。研究表明，40%~80%的女性肿瘤患者会面临不孕的风险[2]。因此，为了恢复年轻肿瘤患者未来的生育能力和内分泌功能，这些癌症患者可进行卵巢组织冷冻保存（ovarian tissue cryopreservation，OTC）[3]。卵巢组织玻璃化冷冻保存是一种借助玻璃化冻存液通过快速冷却，使细胞处于玻璃化状态从而避免冰晶形成的技术，该技术易于执行，可以简单、快速地保存复杂结构[4-5]。但冻存过程中的卵泡丢失及损伤仍是该技术面临的巨大挑战[6]。卵巢组织冻存过程中的损伤以及移植后血管的再生是触发卵泡凋亡的关键步骤，而凋亡是卵泡闭锁的重要原因[7]。如果细胞凋亡程序可以被抵抗，细胞死亡可能被阻止[8]。鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一种重要的具有生物活性的鞘氨脂，可调节多种细胞增殖过程，包括细胞生长和细胞分化[9]，并平衡由神经酰胺水平升高而导致的细胞凋亡[10]。小鼠实验表明，注射S1P可以保护卵巢免受放射治疗引起的损伤[11]。在本研究中，本文旨在评估S1P对小鼠玻璃化冻融卵巢移植后卵泡凋亡的影响，为抑制冻存卵巢移植后凋亡提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物21日龄及6～8周龄清洁级ICR雌性小鼠，购自宁夏医科大学实验动物中心［许可证号：SCXK（宁）2020-0001］，所有涉及的动物实验及程序均获得宁夏医科大学实验动物福利伦理审查委员会的批准，并严格按照国家研究委员会实验动物护理和使用指南的要求进行实验。实验动物移植后暂时饲养于动物周转单元。光照时间周期为12 h照明/12 h黑暗，动物室室温保持在22～24℃，湿度保持在40%～50%，自由取食饮水，定期更换鼠笼和垫料并消毒。

1.1.2 主要试剂S1P（sigma，型号：S9666），DMEM/F12培养基（HyClone公司），二甲基亚砜（DMSO）（MP Biomedicals公司，型号：196055），牛血清白蛋白（BSA）（Solarbio公司，型号：A8020），1%戊巴比妥钠，组织冰冻包埋剂（美国SAKURA公司），HE试剂盒（LEAGENE公司，型号：DH0006），TUNEL检 测 试 剂 盒（Vazyme公司，型号：A113-02），DAPI溶液（Solarbio公司，型号：C0065），Trizol（Ambion公司，型号：15596206），5x AII-In-One RTMasterMix（abm公司），EvaGreen 2x QPCR MasterMix-Low ROX（abm公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 液体的配制 基础培养液：DMEM/F-12培养基+1%青霉素-链霉素+1% DMSO；培养液：含有10%牛血清白蛋白（BSA）的基液；预平衡液：含有1.5 mol·L-1乙二醇（EG）的基液；玻璃化液：实验室自主研发的EG5.5-30玻璃化液。复苏液一、复苏液二、复苏液三：分别含0.5 mol·L-1、0.25 mol·L-1、0.125 mol·L-1的蔗糖液。

1.2.2 卵巢的获取21日龄ICR雌性小鼠按体质量（0.1 mL/10 g）腹腔注射1%戊巴比妥钠，待麻醉之后颈椎脱臼处死，用75%酒精棉球擦拭背部皮毛，剪开小鼠背部皮肤及背膜，剥离双侧完整卵巢。

1.2.3 实验分组 新鲜对照组；冻存对照组；S1P干预组（冻存及解冻过程全程添加2μmol·L-1S1P）。每组24枚卵巢，移植的2 d及14 d各12枚卵巢，6枚进行HE染色后的卵泡百分比计数，另外6枚进行TUNEL法及q-PCR法检测凋亡。

1.2.4 玻璃化冻存及解冻过程 将各冻存液于37℃CO2培养箱中提前预热1 h，将卵巢随机置于各组（n=24）的培养液中培养1 h，再放入预平衡液中7 min，接着在玻璃化液3 min之后迅速投入液氮罐中保存，冻存至少3 d以后，将卵巢从液氮中取出复苏，置于37℃CO2培养箱内预热的复苏液一、复苏液二、复苏液三各10 min，最后放入培养液中置于37℃CO2培养箱中培养2 h。

1.2.5 卵巢肾被膜下移植 将6～8周龄雌鼠按0.1 mL/10 g小鼠体质量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，75%酒精擦拭背部，剔除背部绒毛，剪开约1.5 cm皮肤，剪开肾脏两侧的肌膜约0.5 cm，找到卵巢及肾脏，摘除卵巢并结扎输卵管以去势；在体视显微镜下轻柔缓慢的将复苏后的玻璃化冻存卵巢塞入肾被膜下。缝合伤口，等待苏醒。分别于2 d、14 d后取材。

1.2.6 组织切片及HE染色 移植卵巢取出后，4%多聚甲醛固定过夜（18～24 h），梯度酒精脱水，石蜡包埋后连续切片（5μm），每5张切片选取1张，进行HE染色。

1.2.7 正常卵泡计数HE染色后每张切片选取5个高倍视野，根据卵泡形态计数原始卵泡、初级卵泡、正常卵泡、闭锁卵泡的百分数，进行统计学分析。

1.2.8 TUNEL检测凋亡 按照Vazyme A113-02 TUNEL试剂盒操作说明书进行。卵巢取材后冰冻切片，4%多聚甲醛溶液固定30 min，PBS清洗三次，每次5 min；轻轻去掉多余液体，用1×PBS制备浓度为0.2%的TrionX-100溶液，室温孵育15 min；PBS溶液润洗3次，每次5 min；滴加100μL 1×Equilibration Buffer，室温平衡孵育30 min。然后在样本上滴加50μL TdT孵育缓冲液，置于湿盒内37℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；用1×PBS配制浓度为2μg·mL-1的DAPI黑暗中复染5 min，PBS洗3次，每次5 min；抗荧光淬灭剂封片，荧光显微镜在620 nm荧光下观察BrightRed红色荧光；在460 nm下观察DAPI的蓝光荧光。于高倍镜下随机选取3个视野，统计凋亡细胞数量，计算凋亡指数；凋亡指数=（凋亡细胞数/细胞总数）×100%。

1.2.9 凋亡基因mRNA的检测Trizol提取卵巢总RNA并反转成cDNA，实验步骤依据试剂盒要求进行；然后以cDNA为模板，β-actin作为内参，以Caspase3、Bax、Bcl-2引物进行PCR扩增，引物序列见表1。mRNA表达水平根据2-ΔΔCt法计算。

表1 PCR引物序列

1.3 统计学方法

实验数据采用SPSS 18.0软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 S1P干预改善玻璃化冻存卵巢移植后的卵巢组织形态，维持卵泡数量

HE染色结果表明，移植2 d后，各组大卵泡形态均出现不同程度的变形，且不易着色，颗粒细胞稀疏成片状，卵母细胞皱缩加重。冻存对照组卵泡闭锁较多，S1P干预组闭锁卵泡少于冻存对照组（P<0.01），高于新鲜对照组（P<0.01）；正常卵泡数目高于冻存对照组，低于新鲜对照组（P<0.01）。与冻存对照组相比，S1P干预组有较多的原始卵泡及初级卵泡（P均<0.05）；与新鲜对照组相比，原始卵泡及初级卵泡数目较少（P均<0.01）。见图1、图2A。

移植14 d后，冻存对照组卵巢结构松散，大量卵泡丢失，随着移植周期的延长，闭锁卵泡增加，卵巢结构受到严重打击。与冻存对照组相比，S1P干预组卵巢结构较完好，部分卵泡发育为有腔卵泡，正常卵泡、原始卵泡及初级卵泡数目较多（P<0.05），闭锁卵泡较少（P<0.01）。与新鲜对照组相比，S1P干预组正常卵泡、原始卵泡及初级卵泡数目较少（P<0.01），闭锁卵泡较多（P<0.01）。见图1、图2B。

图1 小鼠冻存卵巢移植后卵巢组织切片HE染色

图2 小鼠冻存卵巢移植后各级卵泡百分比（n=6）

2.2 S1P干预降低玻璃化冻存卵巢移植后的卵巢凋亡

TUNEL红色荧光表示凋亡细胞，移植2 d后，凋亡主要集中于大卵泡的颗粒细胞中，与冻存对照组相比，S1P干预组荧光强度明显减弱，与新鲜对照组相比，荧光较强。见图3A。各移植组卵巢组织细胞凋亡率表明：S1P干预组卵巢凋亡率低于冻存对照组（P<0.01），而高于新鲜对照组（P<0.01）。可见冻融过程中添加S1P后有效抑制了冻融卵巢移植后颗粒细胞的凋亡。见图3B。

图3 小鼠冻存卵巢移植2 d后卵巢组织TUNEL染色

2.3 Real-time PCR检测凋亡基因Caspase3、Bax、Bcl-2的表达

Real-time PCR结果表明，移植2 d后，S1P干预组凋亡基因Caspase3及促凋亡基因Bax mRNA表达均低于冻存对照组（P<0.01），但高于新鲜对照组（P<0.01）；抗凋亡基因Bcl-2 mRNA表达高于冻存对照组（P<0.05），而低于新鲜对照组（P<0.05）。移植14 d后，S1P干预组Caspase3、Bax mRNA表达低于冻存对照组（P<0.05），但高于新鲜对照组（P<0.05）；Bcl-2 mRNA表达高于冻存对照组（P<0.01），低于新鲜对照组（P<0.05）。从mRNA水平上证明S1P干预组卵巢冻融移植后凋亡低于冻存对照组。见图4。

图4 小鼠冻存卵巢移植后卵巢Caspase3、Bax、Bcl-2 mRNA表达

3 讨论

截至目前，全球通过OTC和卵巢组织移植技术（ovarian tissue transplantation，OTT）分娩的新生儿已经超过145例[12]。在接受治疗的318名患者中，95%的患者能够恢复月经和正常激素水平[13]。这些研究结果给众多抗癌的年轻患者及青春期前的女孩带来了生育的希望，但是在此技术发展的十余年，仍然处于实验阶段，面临着巨大挑战。冻存及移植过程引起的卵泡凋亡导致卵泡发育停滞和闭锁以及移植后缺血再灌注及氧化应激引起的原始卵泡丢失是OTC和OTT面临的两个重要挑战。S1P在哺乳动物的生理和病理过程中起着重要的作用，它调节细胞生长、增殖、分化、细胞存活、迁移和血管生成[14]。有研究指出，细胞的生存与死亡是由神经酰胺（Cer）、鞘氨醇（Sp）及S1P相对量的水平决定。Cer是一种细胞凋亡的诱导分子，细胞内Cer水平升高能直接导致细胞凋亡[15]。应激、射线照射、细胞毒性物质刺激等因素诱导的细胞凋亡都与细胞内Cer水平升高有关，而S1P是一个重要的存活因子，能直接对抗Cer和Sp诱导的细胞凋亡[15-16]。S1P可显著降低多种刺激因素如化疗药物、辐射、热休克等诱发的卵母细胞凋亡，有效保护卵巢组织[17]。因此，本研究为了评估S1P在小鼠卵巢玻璃化冻融移植过程中是否具有抗卵泡凋亡作用，给予了冻存前、冻存及冻存后全过程的S1P干预。

HE染色形态学检测发现：移植后2 d，冻存对照组及S1P干预组卵巢组织均出现不同程度上的大卵泡变形的情况，其颗粒细胞间质疏松，卵母细胞出现固缩，绝大多数大卵泡出现凋亡趋势。据文献报道，卵巢组织在移植后的早期至少有75%的卵泡丢失[18]。本次实验中，冻存对照组卵泡发生闭锁，添加S1P后，与冻存对照组相比，闭锁卵泡较少，原始及初级卵泡较多。移植14 d后，随着移植周期的延长，冻存对照组卵巢结构松散，大量卵泡丢失，闭锁卵泡增加，卵巢结构受到严重打击。较冻存对照组，S1P干预组卵巢结构较完好，部分卵泡发育为有腔卵泡，原始卵泡及初级卵泡数目相对较多。在形态上，卵巢得到较好的保护。原始卵泡是整个生殖寿命中发育卵泡和卵母细胞的来源。研究表明，绝大多数原始卵泡会在卵巢组织冻存和移植过程中丢失[19]，而最终决定移植卵巢寿命的是移植卵巢组织中存活下来的原始卵泡的数量[20]。形态学研究结果提示，S1P的干预较单纯的玻璃化冻存组能够保留尽可能多的原始卵泡。

为了探究这种保留较多的原始卵泡的机制是否与S1P的抗凋亡相关，本研究观察了TUNEL荧光结果，发现移植2 d后，S1P干预组颗粒细胞凋亡率低于单纯玻璃化冻存组，说明添加了S1P后，有效抑制了颗粒细胞的凋亡。移植14 d后TUNEL检测无法检测到凋亡细胞，这可能是由于移植后2周死亡卵泡已经消失，此现象在以往研究中也有相似报道[21]。移植2 d和14 d后，冻存组凋亡基因Caspase3以及促凋亡基因Bax表达均高于S1P组，而抗凋亡基因Bcl-2表达均低于S1P组，从mRNA水平验证S1P的干预对卵巢冻融移植后的抗凋亡作用。

综上所述，小鼠卵巢玻璃化冻存过程中给予2μmol·L-1S1P的干预可提高卵巢移植后的卵泡存活，可能的机制与其抗凋亡作用有关。