脱氧雪腐镰刀菌烯醇单克隆抗体的制备及间接竞争ELISA方法建立

孙亚宁，李青梅，杨苏珍，胡骁飞，杨继飞，张颖硕，陈琳琳，邢云瑞，邓瑞广，张改平,2*

(1 河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002；2河南农业大学 牧医工程学院，河南 郑州 450002)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇又称呕吐毒素(deoxynivalenol，DON)，是一种主要由曲霉、青霉及镰刀菌产生的单端孢霉烯族真菌毒素，在大麦、玉米、小麦、燕麦、黑麦等谷物、谷物制品及饲料中广泛存在[1-2]，主要与小麦赤霉病和玉米穗腐病的发生有关，在我国长江、淮河、黄河等流域呈现多发态势[3]，普通的加工和烹饪对其浓度没有显著影响[4]。DON的毒害作用主要干扰蛋白质和DNA的合成[5]，引起动物厌食症、呕吐、肌肉及肠出血、细胞毒性和免疫毒性等[6]，且与黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等真菌毒素有协同毒性[7]，严重危害动物[8]和人类身体健康，影响我国农业、畜牧业及食品安全的健康发展。很多国家对DON制定了严格的限量标准，我国《食品安全国家标准食品中真菌毒素限量标准》中对谷物及其制品中DON的限量标准为不大于1 000 μg/kg[9]。能够快速准确的检测DON污染，是控制其危害的最有效手段。DON常用的检测方法有薄层色谱法、高效液相色谱等大型仪器法及免疫学快速检测方法等。薄层色谱法[10]主要用于快速定性检测，检测灵敏度较低；高效液相色谱等[11]大型仪器法检测结果准确，为我国国标规定的仲裁法，但耗时较长且价格昂贵，不适合快速筛查；免疫学快速检测方法主要包括酶联免疫吸附测定(ELISA)[12]、免疫层析法[13]、免疫传感器法[14]等，由于具有快速、灵敏、特异、稳定、特别是操作简单等特点，已经普遍应用于真菌毒素的快速检测中[15-16]。建立DON免疫学快速检测方法，制备敏感、特异的DON单克隆抗体是关键。本试验通过N,N′-羰基二咪唑法制备人工抗原，优化免疫程序，通过单克隆抗体技术，控制关键点，制备灵敏、特异的单克隆抗体，并初步建立DON ELISA快速检测方法，为DON免疫学快速检测新技术的研发奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂DON、3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-AcDON)、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-AcDON)、黄曲霉毒素B1，青岛普瑞邦生物工程有限公司；牛血清白蛋白(BSA)，美国Amresco公司；鸡卵清蛋白(OVA)，日本Wako公司；玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A(OTA)、伏马菌素(FB1)、小鼠单抗亚型检测试剂盒，美国Sigma公司；N,N′-羰基二咪唑，美国Aldrich公司；无水四氢呋喃，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、基础培养基1640、选择培养基HAT、HT、PEG-1500，美国Invitrogen公司；羊抗鼠酶标二抗(GAM-IgG-HRP)，美国Jackson公司；试验用水为超纯水，实验室自制；NaOH等其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备3K-18高速冷冻离心机，德国Sigma公司；Bio-Rad-550型酶标仪，美国Bio-Rad公司；HI9321酸度计，美国Hanna公司；超净工作台，美国Forma Scientific公司；AE260电子天平，德国Mettler公司；DK-8D电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司；PURELAB Classic UVF超纯水仪，英国ELGA LabWater公司；93-3定时恒温双向磁力搅拌器，上海亚荣生化仪器厂。

1.3 实验动物SPF级8周龄雌性BALB/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室饲养；小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0购自中国农业大学动物实验室。

1.4 人工抗原的制备及鉴定分析DON分子结构(图1)，选择CDI法利用羟基偶联蛋白制备人工抗原。称取1.8 mg DON，加入400 μL无水四氢呋喃溶解，然后加入18 mg CDI，70℃控温回流加热至完全溶解；室温反应1 h，旋转蒸发仪蒸干，产物用100 μL 二甲基甲酰胺(DMF)溶解。称取7 mg BSA溶解于500 μL PBS中，缓慢加入上述溶液，室温搅拌反应2 h，PBS流动透析72 h，4℃、5 000 r/min离心10 min，去沉淀，上清液即为DON-BSA，-20℃保存备用，同法合成DON-OVA。参照文献[17]紫外扫描法鉴定人工抗原。

图1 DON的分子结构图

1.5 动物免疫及融合备用鼠筛选取SPF级8周龄雌性BALB/c小鼠3只，采用皮下多点注射法免疫人工抗原DON-BSA，共免疫4次，免疫剂量为50 μg/只 200 μL，免疫间隔3周。首次免疫选用FCA与无菌PBS配制的人工抗原等量混合，乳化，后3次免疫佐剂改用FIA。4免1周后，小鼠断尾采血，选用PBS 1∶100稀释。用CBS稀释包被原DON-OVA 为2 mg/L，50 μL/孔包被，37℃温育2 h，PBST洗板4次(下同)；用5%猪血清PBST封闭，200 μL/孔，37℃温育1 h，洗板；晾干密封后于4℃避光保存。间接ELISA鉴定小鼠多抗血清(pAb)中DON抗体的效价，间接竞争ELISA检测抗体对DON的灵敏度。

1.5.1pAb效价的测定 参照文献[18]间接ELISA方法测定pAb效价，加样体积为100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶标板，用5%猪血清PBST铺底，第1孔加1∶100倍pAb，倍比稀释至第7孔，设阴性对照(NC)，37℃温育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%猪血清PBST稀释)，37℃温育30 min，洗板；加TMB显色液室温避光显色5 min；2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取D450值；以待测孔D450值≥阴性对照D450值的2.1倍(P/N≥2.1)，判为阳性。

1.5.2pAb敏感性鉴定 参照文献[18]间接竞争ELISA方法鉴定其敏感性，加样体积为100 μL/孔。取DON-OVA包被的酶标板，加D450值为1.3左右的小鼠血清和DON标准品(质量浓度为10.00,5.00,2.50,1.25,0.63,0.31,0.00 μg/L)作抑制剂，设阴性对照，37℃温育15 min，洗板；加GAM-IgG-HRP(1∶1 000倍用5%猪血清PBST稀释)，37℃温育30 min，洗板；加TMB显色液显色5 min；2 mol/L H2SO4终止反应，酶标仪读取D450值；计算抑制率(B/B0，B0为DON标准品浓度为0时D值，B为DON标准品不同浓度的D值),评价多抗血清灵敏度。

分析多抗血清ELISA检测结果，增加第5次免疫，并检测小鼠血清DON抗体效价及灵敏度，确定融合备用鼠。5免3周后对融合备用鼠进行加强免疫，取免疫原DON-BSA无菌PBS稀释，免疫剂量为50 μg/只 200 μL，腹腔注射。免疫1周后小鼠断尾采血，评价血清效价及灵敏度方法同上，当效价达到1×104及以上时安排细胞融合。

1.6 单克隆抗体制备确定融合备用鼠后准备细胞融合。首先进行SP2/0细胞复苏及扩大培养，选用 RPMI-1640完全培养液培养，使其处于对数生长状态；细胞融合前3 d，再次对融合备用鼠进行加强免疫，免疫方法及计量同1.5。融合前1～2 d制备小鼠饲养细胞；小鼠加强免疫后3～4 d，摘眼球分离阳性血清，脱颈致死小鼠。参照文献[18]方法，选用50% PEG-1500为融合剂进行细胞融合；融合后用HAT培养基重悬，50 μL/孔 加入到提前准备的96孔饲养细胞培养板上，共铺设5板，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。5 d左右半量换液，7～10 d 取上清液进行阳性筛选。

阳性杂交瘤细胞株选用间接ELISA和间接竞争ELISA方法筛选，用PBS将细胞上清1∶4倍稀释进行间接ELISA检测，选取D450≥1.0的孔为阳性孔；然后对阳性孔细胞上清进行间接竞争ELISA检测，选取灵敏度较好的孔转孔扩大培养，经2～3次亚克隆后，筛选效价高、灵敏度好、生长旺盛的杂交瘤细胞株为DON单克隆细胞株，扩大培养并冻存。

选用体内诱生腹水法生产DON单克隆抗体(mAb)[20]，用辛酸/饱和硫酸铵法纯化mAb[21]。

1.7 单克隆抗体免疫学性质鉴定及间接竞争ELISA检测方法建立

1.7.1单克隆抗体亚型鉴定 用小鼠单抗亚型检测试剂盒对DON单克隆抗体亚型进行鉴定[19]。

1.7.2单克隆抗体效价及灵敏度鉴定 鉴定DON单克隆抗体的效价和灵敏度首先应优化ELISA检测方法的包被质量浓度，不同的包被质量浓度呈现出单克隆抗体的免疫学性质不同。选择包被原DON-OVA分别以6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的量包被酶标板，分别测定不同包被质量浓度下抗体效价，选择D450值在1.3左右的孔对应的抗体浓度作为抗体稀释浓度，间接竞争ELISA(方法同1.5)检测抗体对DON的灵敏度，绘制标准曲线计算IC50。选择灵敏度最佳的抗原包被质量浓度为该ELISA检测方法的包被质量浓度，抗体浓度为该ELISA检测方法的抗体工作浓度，该包被质量浓度下相对应的抗体效价为DON单克隆抗体效价，包被质量浓度下测定的抗体灵敏度为DON单克隆抗体的灵敏度，并根据标准曲线计算ELISA检测方法的检测范围(以抗体对DON的20%～80%抑制浓度范围评价即IC20～IC80)[22]。

1.7.3单克隆抗体亲和力的测定 选用BATTY等[23]建立的方法测定DON mAb亲和常数(Ka)。选择包被原DON-OVA 1.50，0.75 mg/L的质量浓度分别包被酶标板并用间接ELISA测定mAb效价，以mAb浓度为横坐标，D450值为纵坐标，绘制间接ELISA反应曲线，按照公式Ka=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数，其中n=[Ag]t/[Ag′]t，[Ag]t、[Ag′]t为2个不同的包被原质量浓度，[Ab]t、[Ab′]t为各包被原质量浓度下50%D450值对应的抗体浓度[24]。

1.7.4单克隆抗体特异性鉴定 选取DON的结构类似物3-AcDON和15-AcDON，以及其他的真菌毒素AFB1、OTA、ZEN、FB1作为交叉反应靶标物，各靶标物用甲醇配置成1 g/L的母液，PBS稀释为所需质量浓度。间接竞争ELISA检测抗体灵敏度，计算各靶标物IC50，根据公式CR=IC50/IC50′×100%计算各靶标物交叉反应率，其中IC50为抗体对DON的灵敏度，IC50′为抗体对各交叉反应靶标物的灵敏度[25]。

1.8 加标回收试验选用PBS配置DON标准溶液100 mg/L，取阴性小麦样品5份，粉碎后加入DON标准品，配置DON含量为1 000 μg/kg的小麦阳性样品(国标限量)。小麦阳性样品各取1 g/份于5 mL离心管中，加入2 mL PBS充分振荡提取15 min，10 000 r/min离心3 min，上清液用PBS稀释10倍后按照间接竞争ELISA检测方法检测，每份样品重复检测3次求取平均值计算小麦样品中所含DON浓度，根据公式计算添加回收率(%)=检测靶标物浓度/添加靶标物浓度×100%，回收率在100%±20%范围内，变异系数(CV)小于15%，认为该检测方法准确率高、稳定性好。

2 结果

2.1 人工抗原鉴定紫外扫描法鉴定人工抗原DON-BSA及DON-OVA，结果见图2，与偶联后的人工抗原紫外吸收曲线相比BSA蛋白紫外吸收曲线有所改变，偶联后吸收峰具备了DON在220 nm处吸收峰的特点，而且在240～280 nm的吸收峰也有所增加，从而初步断定DON人工抗原偶联成功。

图2 人工抗原紫外扫描图谱

2.2 小鼠多抗血清测定间接ELISA法检测小鼠多抗血清效价结果见表1，间接竞争ELISA检测小鼠血清对DON灵敏度结果见表2。结果显示，4免1周后3只小鼠均产生了针对DON的抗体，从而说明DON人工抗原制备成功。但3只小鼠效价均不高，1号鼠效价最高也仅有1∶3 200，若此时融合成功概率较小，为提高融合效率对小鼠进行5免，方法及剂量同4免。5免1周后采血鉴定血清效价及灵敏度，结果见表1，2，结果小鼠5免后抗体水平及抗体灵敏度均没有明显变化。3只小鼠中1号小鼠效价较高，抗体针对DON灵敏度较好，选择1号小鼠进行免疫尝试。将1号小鼠采用腹腔注射的方法加强免疫，1周后采血检测血清效价及灵敏度，结果见表1，结果小鼠血清效价提升至1∶104，满足细胞融合条件，但抗体灵敏度无明显变化。小鼠腹腔免疫1个月后进行再次腹腔免疫，3 d后进行细胞融合，小鼠摘眼球采血收集血清检测效价，结果显示效价再次提高1个梯度。

表1 间接ELISA测定血清效价 D450值

表2 间接竞争ELISA测定血清灵敏度 D450值

2.3 单克隆抗体的制备

2.3.1杂交瘤细胞株筛选 细胞融合9 d后进行阳性孔筛选，间接ELISA检测1∶4倍PBS稀释的细胞上清，筛选D450值大于1.0的孔23孔，对23孔进行灵敏度检测，获得阳性孔13孔。将阳性孔扩大培养，经3次亚克隆后获得2A3-E11单克隆细胞1株，经多次传代，该细胞株能稳定分泌DON单克隆抗体。

2.3.2单克隆抗体的制备 选用体内诱生腹水法制备DON单克隆抗体，注射小鼠3只，收获腹水约10 mL。辛酸/硫酸铵法纯化，PBS透析，-40℃冻存。

2.4 单克隆抗体免疫学性质鉴定

2.4.1单克隆抗体亚型鉴定 用小鼠单抗亚型检测试剂盒对DON单克隆抗体亚型进行鉴定，结果显示DON 2A3-E11株单克隆抗体为IgG1型。

2.4.2单克隆抗体效价及灵敏度测定 分别用6.00,3.00,1.50,0.75,0.40,0.20 mg/L的包被原DON-OVA包被酶标板，不同包被质量浓度下DON单克隆抗体效价结果见表3，不同包被质量浓度下DON单抗灵敏度检测结果见图3。结果显示，当包被质量浓度为0.20，0.40 mg/L 时抗体灵敏度最好，但0.20 mg/L包被时抗体效价偏低，故选择0.40 mg/L 为最佳包被质量浓度。该质量浓度下DON单克隆抗体效价可达1∶1 024 000；一抗工作浓度为45 000倍稀释。

表3 不同酶标板包被质量浓度下DON单克隆抗体效价测定结果 D450值

图3 不同包被质量浓度下DON单克隆抗体灵敏度

间接竞争ELISA检测DON单克隆抗体灵敏度结果见图4，以DON标准品浓度对数值为横坐标，抑制率为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为y=-0.454 7x+1.105 0，回归系数R2=0.990 7，根据回归方程计算IC50为21.507 9 μg/L，检测范围为4.696 8～98.490 0 μg/L。

图4 DON单克隆抗体灵敏度标准曲线

2.4.3单克隆抗体亲和力鉴定 DON单克隆抗体亲和力测定结果见图5，经计算[Ab]t、[Ab′]t分别为3.16×10-10,8.044×10-11mol/L，亲和常数为9.064×108mol/L，说明本试验制备的DON单克隆抗体具有很好的亲和力。

图5 DON单克隆抗体亲和常数测定曲线

2.4.4单克隆抗体特异性鉴定 DON单克隆抗体特异性结果见表4。结果获得的单克隆抗体与15-AcDON有233.70%的交叉反应，与3-AcDON及其他常见的真菌毒素无明显交叉反应，说明制备的DON单克隆抗体具有很好的特异性。

表4 DON单克隆抗体特异性鉴定结果

2.5 加标回收试验DON间接竞争ELISA检测方法的加标回收试验结果见表5，检测小麦样品5份，添加回收率为90.509%～116.016%，平均值为103.989%；CV为3.081%～7.928%，平均值为5.633%，说明该检测方法准确率高、结果可靠。

表5 加标回收试验结果(n=3)

3 讨论

DON属于真菌毒素，其相对分子质量为296.32属于小分子抗原，只具有反应原性，无免疫原性，因此称为半抗原。获得半抗原的单克隆抗体首先需要将小分子与大分子的蛋白质依靠化学键连接在一起形成人工抗原，制备的人工抗原既包含小分子的结构，又具有免疫原性。CDI是咪唑的衍生物，能与氨、醇、酸等官能团反应，且具有高度的选择性[26]。本研究将DON与常用的载体蛋白BSA和OVA利用CDI法仅一步进行偶联，避免了改造过程中的副反应影响[27]，偶联过程简单高效，经鉴定成功制备了DON的人工抗原，且具有很好的免疫原性及反应原性。由于CDI遇水分解，因此人工抗原制备过程中水的存在对偶联影响较大，应注意试剂及环境中水份的控制。

本试验采用传统的弗氏佐剂与DON人工抗原乳化后进行皮下多点注射法免疫小鼠，经过4次免疫后抗体效价偏低，如果继续融合可能会导致融合失败，因此进行了第5次常规免疫，但抗体水平没有明显提升。因皮下注射抗原缓慢释放形成持久刺激，同样剂量和手段进行再次免疫不能对免疫细胞形成刺激提高效价。有资料显示腹腔注射在短时间内大量注入抗原会刺激B淋巴细胞迅速增殖产生大量抗体使多抗血清效价升高[28]，因此为了提高小鼠抗体效价，提高融合成功率，本试验尝试腹腔无佐剂注射来提高小鼠抗体效价。经2次腹腔免疫后多抗血清效价提高了3～4个梯度获得了较好的结果，为单克隆抗体制备过程中小鼠效价低的问题提供了较好的解决途径，对单克隆抗体制备方法的改进及完善具有重要的意义。

近年来，很多国内学者制备DON单克隆抗体，曹娟[29]制备的DON单克隆抗体IC50为1.05 mg/L；张勋[30]制备的DON单克隆抗体IC50为31.6 μg/L；张荣升[31]制备的DON单克隆抗体IC50为119.4 μg/L。本试验制备的DON单克隆抗体对DON的IC50为21.501 9 μg/L，灵敏度有了较大地提升。本试验免疫小鼠的多抗血清对DON的IC50约为1 mg/L，而经过杂交瘤细胞的筛选后，获得的灵敏度提高了约50倍，结果表明，多克隆抗体的灵敏度较差时也有可能筛选出灵敏度较好的单克隆抗体，本试验结果对单克隆抗体的筛选过程具有一定的参考价值。

DON有两种乙酰化结构类似物3-AcDON和15-AcDON，可以通过抗体与两种结构类似物的反应推测单抗的抗原结合位点。张荣升[31]用琥珀酸酐法制备的人工抗原3-HS-BSA免疫小鼠制备的DON抗体与3-AcDON有很好的反应性，而与15-AcDON未见明显反应。本试验制备的DON单克隆抗体与15-AcDON有233.70%的交叉反应，则可印证本试验改造的可能是DON上C15位羟基，因此人工抗原与15-AcDON结构更为相似，制备的抗体与15-AcDON有更好的灵敏度；而与3-AcDON未见明显交叉反应，说明制备的抗体可以有效识别C3位置上的羟基，这个基团为DON的主要致毒基团[32]，因此本试验制备的抗体可以较好地识别具有毒性的DON结构，当DON上C3位羟基发生改变后抗体与它的反应能力下降或不再反应，因此该抗体在DON脱毒等领域也将有广泛的应用[33]。

本试验采用CDI一步法将DON与载体蛋白偶联成功制备了人工抗原，并研究了不同的免疫方式对小鼠多抗血清效价的影响，发现了可以在免疫后期提高小鼠多克隆抗体效价的有效免疫手段。通过单克隆抗体技术获得对DON特异、敏感、亲和力高的单克隆抗体细胞1株，该细胞株分泌的抗体与之前报道的DON单克隆抗体相比具有较高的灵敏度(IC50为21.507 9 μg/L)，且可以有效识别DON的主要致毒基团C3位置上的羟基。基于该抗体建立的间接竞争ELISA方法检测范围为4.696 8～98.490 0 μg/L，可以实现DON的痕量检测；小麦样品中加标回收试验证明该检测方法准确率高、结果可靠，可进一步应用于小麦等谷物样品中DON污染的检测，为DON脱毒研究及免疫学快速检测方法的建立奠定基础。