致细胞病变型新疆BVDV基因2型毒株的分离鉴定及其致病性

李 祯，郭妍婷，陈俊贞，胡新艳，赵新艳，董文丽，贺渊秀，王万顺，李泽宇，姚 刚，冉多良，付 强，史慧君

(新疆农业大学 动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052)

牛病毒性腹泻/黏膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease，BVD/MD)，简称牛病毒性腹泻病，是由牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的接触性传染病，感染动物常表现出高热、腹泻、白细胞减少、免疫抑制、黏膜充血等临床症状，还能引起奶牛产奶量下降、孕牛流产、产死胎以及牛的持续性感染[1-3]。BVDV可通过血液、排泄物等多种途径水平传播，感染BVDV的牛发病率高、病死率低，牛群中相当一部分是BVDV的携带者。BVDV还可垂直传播，感染孕牛产下的犊牛终身带毒，持续排毒，是重要传染源，同时也是生物制品、血清、冻精的主要污染源，对养牛业危害极大[4]。

BVDV毒株有2种生物型，分别为非致细胞病变(non cytopathic,NCP)生物型和致细胞病变(cytopathic,CP)生物型[5]。CP型BVDV接种细胞可使细胞出现病变，具体表现为细胞聚集、拉网、空泡、核固缩等现象。BVDV 5′UTR的核苷酸序列呈高度保守性，常利用其核苷酸序列设计特异性引物，以此对BVDV进行检测和分型鉴定。

本试验在分离BVDV新疆地方株的基础上，对5′UTR基因进行克隆与序列分析，从而了解BVDV新疆株基因型及致病性，为疫病的诊断及致病机制研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞系、病毒株及样品MDBK细胞为本实验室保存；BVDV-TC新疆塔城分离株由新疆农业大学动物医学学院冉多良教授惠赠[6]；样品为新疆博乐地区某养牛场出现腹泻症状的病牛新鲜粪便样品，-80℃保存。

1.2 主要试剂及仪器马血清HS、Trypsin及高糖DMEM、青-链抗生素均购自BI试剂公司；TRIzol购自Invitrogen公司；低熔点琼脂糖、0.33%中性红染液购自Sigma公司；Anti-dsRNA mAB J2(10010200)购自美国SCICONS公司；抗荧光淬灭PVP封片液购自Beytime公司；0.2%磷钨酸购自Hitachi公司；超滤离心管(100 kDa)、0.45 μm滤器购自Merck Millipore公司；反转录试剂盒(CW2569M)购自北京康为世纪生物科技有限公司；细胞培养箱(Eppendorf，Glaxy 170R)、PCR仪(BIO-RAD，C1000)、照胶仪(BIO-RAD，721BR11152)、激光共聚焦显微镜(Zeiss，LSM 510)和透射电子显微镜(Hitachi，HT7700)。

1.3 RT-PCR鉴定将粪便样本加入3倍体积的PBS振荡混匀，4℃离心10 min；取500 μL上清液加入TRIzol 500 μL，充分混匀，加入200 μL氯仿，离心15 min；转移上层液相至新的离心管，加入等体积异丙醇，4℃离心10 min后弃上清；加入75%乙醇 500 μL，4℃离心10 min后弃上清，室温干燥5 min；加入20 μL RNase-free水，反转录后-80℃长期保存。反转录步骤参照康为世纪反转录试剂盒。

参照文献[7]及Primer Premier 5.0软件设计BVDV检测通用引物5′UTR(F：5′-CCTAGCCATGCCCTTAGTAGGACT-3′；R：5′-GGAACTCCA-TGTGCCATGTACA-3′)由苏州金唯智生物科技有限公司合成。RT-PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃ 10 min，4℃保存。

1.4 病毒的传代将病毒处理液接种至80%～90%单层MDBK细胞，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养；接毒后24，36，48，72 h观察细胞病变情况，收集上清液，-80℃保存。

1.5 蚀斑纯化试验使用DMEM对病毒进行10倍梯度稀释,将稀释液接种于单层MDBK细胞中；将无菌的2%低熔点琼脂糖与2% HS DMEM培养液按照体积比1∶1比例混匀后加入到细胞和病毒中，厚度约为2 mm,待凝固后倒置于37℃培养箱中培养；待细胞出现病变，用0.001%的中性红染色，肉眼可见明显的蚀斑；选择清晰的单个蚀斑重培养，RT-PCR鉴定后进行下一轮的蚀斑纯化，如此反复操作5次后得到纯化的病毒。

1.6 病毒的毒力测定取相同TCID50的纯化病毒和BVDV TC株，分别进行10-1～10-8梯度稀释后接种至80%单层MDBK细胞中，设立阴性对照组；分别于病毒感染后12，24，36 h收取细胞和病毒液，反复冻融3次后测定病毒滴度(方法同上)，逐日观察5 d，记录每个稀释度出现病变的孔数,按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。

1.7 理化性质鉴定为了测定分离毒株对乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸性条件、碱性条件、温度、紫外线的敏感程度，分别使用20%乙醚、20%氯仿、0.25%胰蛋白酶、pH 3.0酸性条件、pH 10.0碱性条件、温度条件(56℃作用30 min)、紫外线对分离毒株进行处理，依照上述方法测定病毒滴度。

1.8 免疫荧光试验将纯化病毒接种至MDBK细胞(设立阴性对照)，待细胞病变后用4%多聚甲醛固定；用BVDV p7蛋白免疫血清(稀释比例1∶50)和Anti-dsRNA RNA antibody(稀释比例1∶1 200 4℃孵育过夜，荧光二抗标记驴抗鼠IgG(H+L)常温孵育，PI核染，抗荧光淬灭PVP封片液封片,激光共聚焦显微镜下观察结果。

1.9 透射电镜试验将浓缩病毒液滴在200目碳支持膜铜网上，静置3～5 min，2%磷钨酸负染3次，2～3 min/次，室温干燥后透射电子显微镜下观察。

1.10 病毒核苷酸分析BVDV 5′UTR基因扩增的方法同上。用DNA胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，将其与克隆载体pMD19-T在4℃连接过夜，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布至氨苄青霉素抗性的固体LB培养基中，37℃培养12～16 h后使用PCR鉴定单克隆菌落，将阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司进行测序鉴定。将测序结果与GenBank数据库收录的BVDV基因序列进行Blast比对分析，构建遗传进化树。

1.11 小鼠致病性试验选取4～5月龄健康BALB/c小鼠6只，随机分成对照组和试验组2个组别；试验组通过尾静脉注射108IU/mL病毒液，对照组通过尾静脉注射等体积的DMEM；每隔2 d注射1次，共注射5次后取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及十二指肠等组织，制备病理切片，观察病理变化。

2 结果

2.1 BVDV 5′UTR扩增RT-PCR扩增BVDV 5′UTR基因片段，检测腹泻牛的粪便样本,结果1号样本的PCR产物约为267 bp，表明该样本为BVDV阳性(图1)。

M.DL2000 DNA Marker；1～4.不同的样品；5.BVDV-TC株；6.阴性对照

2.2 病毒的分离培养将盲传15代的分离病毒株接种于MDBK细胞进行增殖培养，设立阴性对照组和BVDV-TC株阳性对照组；分别于病毒接种后12，24，36 h时观察细胞形态变化。结果发现，病毒接种24 h时，MDBK细胞出现病变，表现为皱缩、变圆、碎裂、脱落、聚集后产生合胞体和巨细胞等现象(图2)，表明BVDV-BL314株为CP型。

图2 正常细胞及感染病毒后细胞形态(20×)

2.3 病毒的蚀斑纯化以低熔点琼脂糖作为覆盖物，使用蚀斑方法对分离的病毒进行纯化。经过中性红染色后低熔点琼脂糖上可见透明或乳白色的病毒蚀斑(图3)；挑取单个蚀斑接种到正常的MDBK细胞上增殖，经RT-PCR鉴定呈阳性(图4)。

图3 病毒蚀斑

M.DL2000 DNA Marker；1～6.不同的病毒蚀斑；7.BVDV-TC株；8.阴性对照

2.4 病毒毒力测定使用Reed-Muench方法测定BL314分离株和BDVD-TC株的病毒毒力。病毒感染后24 h，BL314分离株病毒滴度显著性高于BVDV-TC株(*示P<0.05，**示P<0.01)，表明BL314分离株的毒力强于BVDV-TC株(图5)。

注：*P<0.05；**P<0.01。下同

2.5 理化性质鉴定结果分别使用乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸/碱性条件、高温条件、紫外线等处理病毒并测定其滴度变化。乙醚、氯仿、胰蛋白酶、酸、碱、高温、紫外线处理后病毒滴度显著性降低(**示P<0.01)，表明分离毒株对乙醚、氯仿等有机溶剂敏感，对胰蛋白酶敏感，56℃作用30 min病毒毒力降低，紫外线照射30 min可使其失活(表1，图6)。

图6 不同条件处理后病毒滴度测定

表1 病毒理化特性结果

2.6 免疫荧光试验接种分离毒株感染单层MDBK细胞(设立阴性对照)，分别使用BVDV p7蛋白免疫血清和Anti-dsRNA 4℃孵育过夜，驴抗鼠荧光二抗常温孵育后，胞浆中可见绿色荧光，PI核染为红色荧光(图7)。

图7 BVDV-BL314免疫荧光鉴定(200×)

2.7 免疫透射电镜试验病毒吸附铜网后经2%磷钨酸负染，置于透射电镜下观察，可见直径为40～60 nm的球形、外被囊膜的病毒颗粒(黑色箭头所指)(图8)。

图8 BL314分离株形态的电镜观察结果

2.8 BVDV 5′UTR基因克隆与序列分析扩增BVDV 5′UTR基因片段，结果显示PCR产物约为267 bp(图9)。根据分离株5′UTR基因部分区域与GenBank数据库收录的BVDV基因序列进行Blast分析，建立遗传进化树，结果显示，该分离株与BVDV-2a型125c株的遗传距离较近(图10)，因此BL314分离株为BVDV-2a基因亚型。

M.DL2000 DNA Marker；1.BL314；2.阴性对照

图10 BVDV-BL314分离株与其他BVDV株的5′UTR基因系统进化树分析

2.9 小鼠致病性试验结果将病毒尾静脉注射BALB/c小鼠5次后，取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及十二指肠，观察其病理变化。结果显示，脾脏、肺脏和心脏不同程度肿大，有散在的出血点，质地变脆，边缘钝圆，无光泽；肺脏水肿，表面有出血斑点；心脏心肌肥大，血管不明显，心包和心外膜有纤维性肥厚和浑浊，心肌纤维变性、坏死；肾脏边缘变脆、趋向于透明(图11)。取部分病变组织制作石蜡切片，HE染色后观察其病理变化。结果显示，脾脏、肺脏和十二指肠病变较明显，脾脏红髓部分出血严重；肺脏肺泡扩张，肺泡壁增厚且有明显的出血；小肠绒毛代偿性变宽，肠绒毛上皮细胞由单层变为多层，隐窝形态发生变化；心脏和肝脏血管周围可见淋巴细胞浸润，肝脏血管内有淤血，少量肝细胞坏死；肾皮质、肾小管周围有少量出血，肾盂萎缩(图12)。

图11 组织解剖检测结果

图12 病理组织切片检测结果

3 讨论

1946年，OLAFSON等[8]在美国纽约州发现一种发病率高而死亡率低，以发热、腹泻和咳嗽为特征的牛传染性疾病，称之为BVD/MD。目前，该病广泛分布于美国、英国、新西兰、中国、澳大利亚等大型畜牧业国家。BVDV可以感染野生反刍动物，如绵羊、肉牛、奶牛和鹿，可以从病畜的血液、内脏、肠淋巴结组织或呼吸道、乳汁、精液中分离出病毒，给世界养牛业带来巨大的经济损失[9]。2016-2018年，泰国北部、土耳其卡尔斯地区、爱尔兰地区和巴西东北部的帕拉伊巴州BVDV阳性检出率为62.5%～100.0%[10-13]。2018年世界BVDV流行病学调研结果显示，我国动物水平的抗体阳性率为60%～80%，畜群水平抗体阳性率为20%～40%[14]。基于BVDV 5′UTR序列的高度保守性，可以将其分成BVDV-1、BVDV-2和BVDV-3这3个基因型，它们之间的抗原性和遗传性差异较大[15]。BVDV-2型主要包括BVDV-2a、BVDV-2b、BVDV-2c、BVDV-2d四种亚型，流行区域主要包括江苏省、山东省、河南省、青海省、陕西省、新疆维吾尔自治区等地区[16-18]。根据研究显示BVDV-2致病性更强、致动物死亡率更高[19]。新疆是我国的畜牧大省，研究表明该病已在新疆广泛存在。通过对新疆地区BVDV抗体和抗原的检测及流行病学调查，最高抗体阳性率平均在90%以上，严重阻碍了新疆养牛产业的健康发展，给农牧民带来了不同程度的经济损失[20]。

本研究从腹泻牛粪便中分离纯化到BVDV-BL314分离株，分离病毒株接种于MDBK细胞进行增殖培养，可观察到细胞出现皱缩、变圆、碎裂、脱落、产生合胞体等病变。免疫荧光抗原(绿色荧光)主要分布于细胞浆中，而未接种病毒的MDBK正常细胞无荧光出现，表明分离得到的病毒为BVDV。由于世界各国经济贸易频繁，导致BVDV在世界范围内广泛存在，且存在毒株变异较大、毒力增强的现象，此次分离毒株滴度为2×108TCID50/0.1 mL，且毒力高于BVDV-TC分离株；在BALB/c小鼠体内试验中，随着感染BVDV时间的延长，BVDV呈现出在机体内大量复制的现象，BALB/c小鼠试验组与对照组逐渐出现明显的差异。感染小鼠后可引起慢性感染，表现为多内脏器官肿大、出血、变形、质地变脆，边缘钝圆，无光泽；镜检组织内炎性细胞浸润、出血，血管淤血，脾脏及肺脏病变较为严重。

根据以往报道，新疆地区主要流行的病毒株为BVDV-1型，但也存在BVDV-2型[21-23]。本试验根据该分离株5′UTR基因部分区域绘制的系统进化树表明BL314分离株与BVDV-2型参考毒株美国125c株在同一分支上，与印度Ind141353株、美国Olwein#12株、美国USMARC-60780株亲缘性较近，确定BL314分离株为BVDV-2a基因亚型；表明本次调查的新疆牛场中存在BVDV-2a型的感染。

本研究通过BVDV的分离与纯化来了解CP型新疆地方性毒株2a型的流行特点及致病性，为疫病的诊断及致病机制研究奠定基础。