应用生物传感器检测食品中食源性致病菌的研究进展

万 峰，吴雅静

（海军勤务学院，天津 300450）

民以食为天，食以安为先，食品安全是目前政府和人们最关心的问题之一。近十年来，全世界的食品安全问题层出不穷，其中一个重要因素是来自于食源性致病菌的污染。这些能够引起中毒或疾病的微生物包括沙门氏菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌和金黄色葡萄球菌等常见致病菌，它们大多通过食物传播，且有着非常强大的自我扩散能力[1]。食品在采集、加工、运输、贮藏等环节极易受到这些微生物的污染。而刚被污染的食品通常没有明显的食品属性变化，感官评价检验极难发现。人一旦摄入被污染的食品，较为典型的症状就是腹泻，重则甚至会危害生命安全。由此可见，在摄食前，对于食品中的食源性致病菌的检验尤为重要。但传统的菌落分离培养计数法不仅检出速度慢，而且灵敏度低，不能实现有效的实时快速监控[2]。因此亟需寻找一种简便、高效、快速的检测方法。

目前较常用的手段有依赖DNA 体外扩增原理或利用相关细菌的特异性基因来实现对食源性致病菌快速检验的PCR 检测、基因芯片等分子技术，以抗原与抗体的特异型反应为基础建立的ELISA 检测、胶体金免疫层析等免疫学技术[3]，这些现代化技术虽能不同程度改进传统方式检测的缺陷，但或多或少都存在不足之处，如试验成本高、操作技术要求高、方法不成熟等问题。近年来，随着高新科学技术和计算机的发展及新材料的介入，生物传感器已成为越来越多科学家用来检测和监控食品中食源性致病菌的一条有效途径，该方法具有高特异性和高精度的同时又能高效实时监测微生物且成本较低廉，克服了上述方法的缺陷，联合目前常用的分子技术或免疫学技术更是表现出优良的性能，在食品安全领域中具有广阔的应用前景和市场价值，因此新型传感器的开发吸引了众多科研工作者的目光。

本文主要对生物传感器原理、类型以及几种目前常用生物传感器在检测食品中食源性致病菌的研究进展等方面进行系统综述，阐述其在食品安全中的应用和重要价值，并针对当前生物传感器存在的相关问题进行总结和展望，以期为开发新型生物传感器和建立快速检测食源性致病菌体系奠定一定的理论基础。

1 生物传感器简述

生物传感器是由生物感受器（识别元件）和换能器及信号放大装置构成的一种分析检测工具。其原理基于包含多种生物活性材料（酶、抗体、抗原、核酸等）的生物感受器与待检测物质发生生物学反应产生的浓度信号，由换能器转换成可定量处理的电信号等其他信号，经二次仪表放大输出，从而获得待检物数量和浓度的信息[4]。具体来说就是目标分析物能够与抗原或抗体、酶、核酸、受体或噬菌体等生物识别元件特异性结合后会产生生物信号经过基于电化学、光学、压电、磁力和温度等一种或多种技术结合而设计成的信号转换器（即换能器）输出可供检测的电信号，信号再经过系统分析处理便可得到实验数据。

生物传感器按识别元件可分为酶传感器、微生物传感器、组织传感器、细胞传感器和免疫传感器等，识别元件是传感器的关键。按换能器类型不同又可分为电化学生物传感器、压电生物传感器、热学生物传感器和光学生物传感器（图1）[5]。在各种类型的传感器中，电化学生物传感器、压电生物传感器和光学生物传感器结合不同的识别元件在食品检测中应用较为广泛且具有良好的发展前景。

图1 传感器的组成和分类[5]Fig.1 Components and classification of biosensor[5]

2 生物传感器在食源性致病菌检测中的应用

2.1 电化学生物传感器

电化学生物传感器是生物传感器发展历史上第一个报告的商业化生物传感器[6]。其原理是利用电极作为换能元件，通过生物识别元件捕获目标分析物后在电极界面上进行的电化学反应从而引起生物传感器表面发生电流、电位、阻抗或电导变化，根据监测这些电信号的变化来定量目标分析物的浓度（图2）[7]。故按最终测量信号的不同可将电化学生物传感器分为阻抗型、电流型、电势型和电导型4 种类型，其中阻抗型和电流型生物传感器在检测细菌方面应用较多，而电势型和电导型生物传感器主要用于检测病毒和微生物毒素，在实际应用并不是很广泛。

图2 电化学生物传感器的示意图[7]Fig.2 Schematic representation of the electrochemicalbiosensor[7]

由于电化学生物传感器研究相对较早同时也较其他传感器更加成熟，近年来，国内外学者对于研究开发各种类型生物传感器做了大量的工作并取得了一些重要的成果，基于电化学的DNA 方法，基于电化学抗体的方法，基于使用适配体、抗菌肽（Antimicrobial Peptides,AMP）和噬菌体作为识别元件来检测食源性致病菌的研究越来越多。如表1 所示列举了近5 年来电化学生物传感器的重要研究和应用。通过近年来的文献可以发现，一方面，识别元件多集中在对核酸和抗体的研究上，同时AMP 和噬菌体由于稳定性高及对细菌的专一性强也越来越受到研究者的重视，具有潜在的开发应用价值；另一方面，根据实际需要，发展同时用于致病菌的多重检测并能够区分死细胞和活细胞的的电化学生物传感器已成为新的趋势。此外，如何提高电化学传感器的灵敏度、特异性、高效性也是近年来研究的热点问题之一，其关键在于固定在电极表面的电极材料是否能够与生物识别元件完美结合，所以研究者们致力于研究和获取固定在电极表面的新型材料，其中碳基电极及碳纳米修饰材料是电化学分析科学家所热衷研究的电极材料，如石墨烯、碳纳米管等。还有报道关于对电化学生物传感器的处理组件、分析系统、设备包装等的设计和改进以提高对样品检测的特异性和准确度或通过附加操作赋予传感器更多的功能性，为电化学生物传感器的发展提供了更多的选择[8]。如Wang 等[9]开发了一种基于磁珠与叉指型电极和酶反应系统结合的电化学阻抗免疫传感器，用于大肠杆菌O157:H7 检测，灵敏度和重复性较好。

表1 近五年来电化学生物传感器在食品中的研究和应用Table 1 Research and application of electrochemical biosensors in food in the past five years

2.2 光学生物传感器

光学检测使用化学发光，显色或荧光等光信号来定量目标化合物的浓度。目前常用的技术有比色、荧光、化学发光、表面等离子共振（Surface Plasmon Resonance,SPR）、表面等离子体共振成像（Surface Plasmon Resonance imaging,SPRi）技术和表面增强拉曼光谱（Surface-Enhanced Raman Scattering,SERS）等。比色生物传感器可以使人们通过观察反应液颜色的变化即时地检测到致病菌的存在。利用样品在滤纸或膜中因毛细作用流动扩散以及通过金纳米颗粒（Au NPs）聚集而产生颜色的变化，杜邦公司生产的基于侧流层析检测（Lateral Flow Assay,LFA）的生物传感器以及梅里埃生物公司设计的产品分别可以在10 min 内通过特异性抗体检测大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌、李斯特菌和在15 min内检测出链球菌及嗜肺军团菌[31]；Park 等[32]开发了一种集成的螺旋微流控系统，用于检测污染的水和牛奶中的鼠伤寒沙门氏菌和副溶血性弧菌，在80 min内达到的最佳检测限是50 CFU/mL。荧光生物传感器是指通过荧光染料、量子点（Quantum Dot,QDs）或其他具有荧光效应的材料“标记”被检测物体，并以荧光信号为检测信号的一类生物传感器。Wang等[33]将金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌特异性的适配体修饰在NaYF4:Ce/Tb 和NaGdF4:Eu 纳米材料以及纳米磁珠上设计了一种生物传感器以实现对两种致病菌的定量检测；化学发光生物传感器是基于化学发光反应为换能反应而研发的，最常见的化学发光生物传感器基于三磷酸腺苷（ATP）感应，几乎所有生物都会产生ATP 作为主要能量存储分子，通过生物发光或酶促反应来检测ATP 发光。如Kim 等[34]建立了光热裂解ATP 生物发光生物传感器用于快速、灵敏地检测多种致病菌；SPR 生物传感器是依据光在棱镜与金属膜表面上发生反射形成的消逝波与介质表面等离子波发生共振，从而引起反射光强度的大幅度减弱且受介质界面折射率的影响，将生物识别分子结合在金属表面，通过影响这种光学现象来实现检测的目的。目前，已有多种商业传感器研发上市，如SPREETA 和BIACORE 3000 等已被广泛用于检测食品中大肠杆菌、肠炎链球菌、鼠伤寒沙门氏菌和单核细胞增生李斯特菌。SERS 检测原理主要是依赖于拉曼散射效应而产生的指纹图谱被由特殊材料制备的样品表面的电磁场增强信号而达到特定实时检测的一种方法。

Yoo 等[35]综述了2016 年以前已应用于检测微生物的一些重要光学传感器，讨论了它们各自的优点和局限性并对未来的发展趋势和开发策略提出建议。在最近的研究中，Zhou 等[36]设计了一种基于AMPs 的光纤SPR，可以检测水、水果和蔬菜汁中大肠杆菌O157:H7。在这一研究中，均匀层的银纳米颗粒还原的氧化石墨烯（AgNPs-rGO）纳米复合材料在金膜层之前被固定在光纤上，大大增强了SPR 响应。Masdor 等[37]研究了一种SPR 技术，使用特定的多克隆抗体作为识别元素，用于检测食品样品中的空肠弯曲杆菌。Tokel 等[38]开发了一种便携式，多重且廉价的微流体集成SPR 平台，可实现对大肠杆菌快速定量检测。Aura 等[39]报道了一种金纳米颗粒（AuNPs）增强的表面等离子体共振成像（SPRi）生物传感器，用于快速灵敏地检测金黄色葡萄球菌和单核细胞增生李斯特菌。相似地，Morlay 等[40]开发了一种基于SPRi 技术的生物传感器用来特异性检测单核细胞增生李斯特氏菌的免疫传感器，30 min 内即可对完成莴苣样品中病原菌的检测。Duan 等[41]最近报道了一种基于纳米金颗粒修饰聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜作为增强拉曼散射的活性基质与适配体（Apt）结合后形成Apt-Au-PDMS 三明治夹心复合物为探针的新型SERS 传感器方法可同时快速检测的海鲜样品中的副溶血性弧菌和沙门氏菌，检测限分别为18 和27 CFU/mL，目标菌的回收率为82.9%～95.1%。

光学生物传感器与电化学传感器的主要识别元件大体相似，其中以抗体、核酸和酶报道居多，材料的折射率是提高SPR 传感器灵敏度的关键，目前较理想的材料就是纳米颗粒，通常选择表面修饰Au 纳米颗粒，能够提高颗粒的分散性，增强光学传感的表面积，提供更多的结合位点。较电化学生物传感器来说，光学生物传感器最显著的优势就是可开发用于现场即时检测的可视化生物传感器，微流控和光学一体化技术的不断发展，使开发现场即时检测系统变得更加可行。此外，前人已对基于智能手机系统研发的既有光源又有光检测器的生物传感器研究开发多年，既可以提供简单使用界面又可以实现快速检测[31]。由于不同类型的光学生物传感器有各自的优势，为了提高检测的灵敏度和特异性，在实际应用中，开发的生物传感器并不是使用单一技术，往往包含多种光学手段。可视化光学生物传感器是今后研究和开发的重点。

2.3 压电生物传感器

压电生物传感器是指基于压电效应设计的生物传感器，由于其简单和低成本而广泛使用，其典型代表是声表面波传感器（Surface Acoustic Wave,SAW）和石英晶体微天平传感器（Quartz Crystal Microbalance,QCM）。SAW 生物传感器是利用材料的压电效应以及声表面波特性受环境因素影响这一原理而制成的；QCM 生物传感器的原理是将分析物结合在晶体传感器表面而引起石英晶体共振频率的变化，共振频率取决于与传感器表面结合的分析物的质量，即可实现实时地检测微量分析物浓度[42]。Shen 等[43]研究了基于免疫磁性纳米粒子（Beacon Immunomagnetic Nanoparticles,BIMP）的QCM 传感器，可以高特异性，高稳定性地成功检测出牛奶中的大肠杆菌O157:H7，检出限为53 CFU/mL，整个过程仅用了4 h。Masdor 等[44]设计纳米粒子增强的QCM 生物传感器用于检测空肠弯曲杆菌，通过晶体表面固定的抗体来特异性识别空肠弯曲杆菌。Dong等[45]开发了基于AMPs 的QCM 方法进行检测水体中的大肠杆菌O157:H7，检出限为400 CFU/mL，10 min 之内即可完成快速检测。Yu 等[46]构建了基于ssDNA 适配体的QCM 传感器，能够与大肠杆菌O157:H7 特异性结合，检测限和检测时间分别为1.46×103CFU/ml 和50 min。在对食源性致病菌检测的研究中，大部分集中在QCM 生物传感器上，SAW 在食品中的应用较少，尽管尚未报道便携式SAW 生物传感器，但基于SAW 的设备是用于病原体现场检测是较有前途的工具，对其研究价值不可忽视。Xu 等[47]采用覆盖膜材料对SAW 传感器定量检测金黄色葡萄球菌作了对比研究，结果表明勒夫波（Love Wave）检测可以得到高灵敏度和低检测限的结果，但谐振器损耗大、品质因数低。基于此种情况，齐晓琳等[48]采用叉指电极中间内置敏感区域的谐振器结构设计了一种新型SAW 传感器来实现对金黄色葡萄球菌实时特异性检测。

鉴于由压电效应设计的生物传感器具有较高的灵敏度，即使目前在食源性致病菌检测领域应用较少，但有充分的理由相信它在未来食品安全中将占有一席之地。为了更好地提高检测性能，在现有研究中，压电传感器常需要与其他技术结合，将各种方法的优点结合起来以发挥最优功效。例如，电化学、光学原理与压电技术相结合可以获得更多的样品检测信息。

2.4 其他生物传感器

此外，还有一些其他生物传感器如半导体感器、磁力传感器、微流控系统集成的生物传感器、核磁共振生物传感器也在病原菌检测方面得到广泛应用[49]。这类生物传感器基于最新的科技手段，具有灵敏度好、特异性强和快速高效等特点，其在致病菌检测和监控应用方面的前景非常可观。相信随着生物技术的不断进步，将不断涌现出越来越多新型生物传感器应用到食源性致病菌的检测。

3 商业化生物传感器

近年来，生物传感器因具有优越性能而在食品以及医疗领域中展现出了巨大的应用潜力。在医疗方面，生物传感器主要用作药物分析、诊断和监测肿瘤、自动检测血糖等；在食品工业中，与生物传感器相关的主要集中在食品安全检测和监管方面，包括致病菌的快速检测和食品中农药及毒素的残留等，其中尤以在发酵乳制品、肉制品和蔬菜中的应用最为广泛，主要是由于乳制品和肉制品富含微生物生长繁殖的蛋白质，因此极易受到污染引起腐败变质，而在蔬菜中主要是检测农药或毒素的残留。据报道，越来越多具有快速、灵敏、专一、高效的生物传感器被成功研发并投放到市场，截至目前全球市场已有超过几十余种产品，并根据食品的特点结合传感器的不同类型以达到对致病菌的精准检测。常见应用于检测食源性致病菌的商业化生物传感器见表2。

表2 用于食品检测常见的商业化生物传感器Table 2 Maincurrently commercial biosensors in food detection

4 各类传感器的优缺点

虽然生物传感器对于检测食源性致病菌较传统方法和其他一些检测手段来说具有独特的优势，如灵敏度高、检测快速等。但不可忽视的是它仍然存在着诸多问题，其中最重要和最关键的就是稳定性和精确度。不同类型的生物传感器虽各有所长但同时也有一定的缺陷，其优缺点总结如下（表3）。总体来说，商业化的生物传感器还是少之又少，目前正在研发和报道的传感器仍然存在一些问题有待解决：区分死菌和活菌能力。传统的平板菌落计数法反映的活菌的数量，而多数生物传感器往往检测的死细胞和活细胞总的数量；检测样品有限。大部分生物传感器只适用于检测液体样品，如牛奶，果汁或肉汤等，应用于复杂食物可能会引起食物基质的严重干扰；目标菌的检测较为单一，大部分生物传感器只能检测单一病原菌，而在食品质量监控中往往需要检测多种微生物[53]。

表3 不同类型传感器的比较Table 3 A comparison of the different types of biosensors

基于各类传感器的特点和适用范围，如何针对性地改进和完善传感器的性能仍需科研工作者为此不懈努力，将各类传感器的优势更好地整合到一起需要进一步积极探索和研究。

5 前景与展望

相较于传统方法，生物传感器技术操作简单，检出速度快，已在食品检测领域取得突破并日趋成熟，但由于抗干扰能力差，可靠性低及各种复杂的因素限制了其在病原菌检测中的应用，影响了该技术的推广和应用，尤其是对于起步和发展较晚的我国来说，许多方法仍处于实验室阶段，现今尚无可靠的商业化传感器走向市场，大量的基础研究工作仍有待开展。理想的传感器的不仅要求灵敏度高，在短时间内提供实时可靠的结果，而且能够特异性区分复杂食品中的目标细菌。如何提高传感器的灵敏度和特异性、可重复性和稳定性、降低成本以及使其更加便携化和智能化是当前亟需解决的问题也是未来的发展趋势。

解决生物传感器目前存在的一些主要问题的关键是要选择更具体的受体和更灵敏的基质材料，大量的文献报道有越来越多的新型材料，如石墨烯、金属纳米粒子、分子印迹聚合物被应用到生物传感器上，结合当前先进的纳米技术、3D 技术、CRISPR 技术、微流体技术等就可能成功地构建灵敏的生物分析工具，但同时还需要开展更深层次的理论研究，以更好地理解新兴材料与生物分子的相互作用机制。如何区分死菌体和活菌体，目前AMPs 和免疫磁球是一种有效的手段，基于AMPs 和免疫磁球方法研制的生物传感器均有报道。在实际应用中样品组成非常复杂，为了避免干扰，用于检测快速食品中病原菌的生物传感器的开发必须依赖于食品的类型和食品中所含的营养物质，如脂肪、蛋白质和纤维。因此，在今后实际应用中，可能需要为每种食品开发特定的传感器或特定的分析工具和取样方法。关于样品的预处理，多数文献中没有过多描述，需要明确的是大部分生物传感器均需要对样品进行预处理，只有少数生物传感器无需对样品进行预处理，液体样本大多使用缓冲液稀释、过滤或离心方法，更复杂的液体样品也可能需要匀浆处理。动物性食品样本需要额外的步骤，通常是要在合适的溶液中消化，然后进行离心、稀释或过滤。因此，生物传感器自动化或便携式预处理系统同样是未来研究的重要方向，检测设备趋向于小型化、简单化、成本低廉、高通量和集成多元化发展。此外，还有一些技术和手段尚处在起步阶段，如纳米颗粒碰撞电化学和智能包装等，为开发新一代的智能生物传感器提供了新的思路。

综上所述，生物传感器技术的发展势必会引起食源性致病菌检测方法的变革与创新，在食品安全领域中有着巨大的开发应用价值。