10 种广东药食两用植物的抗氧化和抗增殖活性评价

万红霞，胡玉玫，贾 强,*，欧阳欢，薛佩芳

（1.广州城市职业学院食品系，广东广州 510405；2.韶关学院英东食品科学与工程学院，广东韶关 512005）

“药食同源”指食物和药物同出一源，在性能上有相通之处，既有药物的作用，亦可当作食物来起到果腹的作用[1-2]。“药食同源”是我国传统医药宝库中的一项重要内容，是近十几年内国际关注的热点之一，从“药食同源”到“药食两用”是国际健康发展大趋势。药食两用植物具有寒热温凉四气与酸苦甘辛咸五味的属性[3-4]，使用时根据四季变化和人体所处的状态选择适宜对象，使人体存在的病理状态恢复至正常状态[5-6]。药食两者使用的原理基本相同，所异者：“食养正气，药攻邪气”。俗语说“民以食为天”“药补不如食补”，通过食补来替代药物治疗，是最理想的养生之道，真正发挥药食两用植物调节机体保健功能预防疾病的功效[7]。

现代流行病学研究充分证明，人体内过剩的活性氧和自由基与多种慢性退行性疾病及肿瘤的发生密切相关[8-9]，摄入和补充抗氧化剂是预防这些疾病的一种有效途径[10-11]。因此，天然抗氧化剂一直是营养与保健食品研究的热门领域之一，药食两用植物是一种重要的天然抗氧化剂来源。药食两用植物因含有种类多样和含量丰富的酚类物质，这些酚类物质可能通过调节机体内环境稳定，缓解细胞内的氧化应激状态从而达到抗氧化的功效[12-14]。在中医对肿瘤的治疗中，可以通过抑制肿瘤细胞DNA 和RNA 合成，诱导肿瘤细胞分化周期失控，诱导肿瘤细胞凋亡，对肿瘤细胞具有毒性作用等途径杀灭肿瘤细胞[15-17]。清热解毒是中医治疗肿瘤的大法之一[18-19]。药食两用植物多数为具有苦寒特性的中草药，具有“清热解毒”功效[20]。

本文选用10 种主产地为广东境内的药食两用植物原料（益智仁、藿香、龙眼肉、橘红、橘皮、高良姜、沙姜、肉豆蔻、佛手、布渣叶）乙醇提取物为研究对象，以清除DPPH 自由基和羟自由基活性为指标研究其抗氧化活性，以抑制小鼠结肠癌MC-38 细胞增殖活性为指标研究其抗肿瘤活性，为进一步研究药食两用植物的开发和利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

益智仁（湛江雷州）、藿香（肇庆高要）、龙眼肉（茂名高州）、橘红（茂名化州）、陈皮（江门新会）、高良姜（湛江徐闻）、沙姜（阳江阳春）、肉豆蔻（佛山南海）、佛手（肇庆四会）、布渣叶（阳江阳西）广州当地药材市场；小鼠结肠癌MC-38 细胞株 中国科学院（上海）细胞库；0.25%胰 酶-EDTA、高 糖DMEM 培养基、胎牛血清（FBS）美国Life-Technologies 公司；CCK-8 试剂盒 日本同仁化学研究所；儿茶素、没食子酸、Folin-ciocalteu 试剂 美国Sigma-Aldrich 公司；DPPH 自由基 东京化成工业株式会社；0.22 μm的过滤器 美国Millipore 公司；96 微孔板、75 cm2细胞培养瓶美国Corning 公司；其它试剂 均为国产分析纯。

3001 型酶标仪、240i 型CO2细胞培养箱 美国Thermo 公司；荧光倒置显微镜 德国Leica 仪器公司；BSC-1300ⅡA2 系列生物安全柜 苏净安泰空气技术有限公司；RE-3000 旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；5418 R 型冷冻离心机 德国Eppendorf 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 广东药食两用植物活性物质的提取 参照文献[21]方法进行并做改进。具体方法为：用粉碎机将原料粉碎，80 目过筛，取样品粉10 g，以w:v=1:20加入70%乙醇，85 ℃热水浴回流提取1 h，4000 r/min离心15 min，分离得滤液。滤渣分别进行第二和第三次提取和离心。将三次滤液合并，旋转蒸发浓缩至20 mL 以内（45 ℃），定容至25 mL，每种样品的做三次平行提取实验，得浓度为400 mg/mL 的提取物样品，分装保存于-80 ℃，备用。

1.2.2 总黄酮和总多酚含量的测定 药食两用植物总黄酮含量的测定采用AlCl3-NaNO2比色法[22]进行。标准品为儿茶素，总黄酮含量以（平均值±SD）μmol 儿茶素当量/g 干物质（μmol CE/g DW）表示。总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu 法[23]进行。标准品为没食子酸，总多酚含量以（平均值±SD）μmol 没食子酸当量/g 干物质（μmol GAE/g DW)表示。

1.2.3 抗氧化活性的测定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除活性的测定 DPPH 自由基清除实验参照文献[24]来进行。样品组为药食两用植物提取物（浓度范围为0～4 mg/mL）和0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，对照组为去离子水和0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，空白组为去离子水和乙醇，均为1:1 混合均匀，在温室避光保存30 min，测定517 nm 处的吸光值。

其中，Ai—样品组的吸光值；Aj—空白组的吸光值；A0—对照组的吸光值。

根据lg（Ei/1-Ei）与lg（浓度）的线性关系来计算样品的半数有效清除浓度EC50（即DPPH 自由基清除率达到50%的提取物浓度），结果以EC50值（平均值±SD）mg/mL 表示。

1.2.3.2 羟自由基清除活性的测定 羟自由基清除实验参照文献[25]来进行并做改进。比色管中先依次加入9 mmol/L FeSO4为0.2 mL 和9 mmol/L 乙醇-水杨酸0.2 mL，接着加入浓度为40 mg/mL（即稀释10 倍）的样品2.4 mL（对照组为去离子水），最后加入8.8 mmol/L H2O20.2 mL（空白组不加入H2O2），摇匀，37 ℃恒温水浴15 min 后取出，在510 nm 条件下测其吸光度。羟自由基清除率的计算参照1.2.3.1 DPPH 自由基清除率计算公式，结果以40 mg/mL 药食两用植物提取物对羟自由基的清除率（%）来表示。

1.2.4 抗增殖活性的测定 抗增殖活性按文献[26-27]进行实验并稍作改进。在37 ℃ 5% CO2条件下，用DMEM（10% FBS）培养基培养MC-38 细胞。用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，离心，将MC-38 单细胞悬液200 μL 接种至透明96 微孔板中（1.5×104个/孔），待细胞贴壁后（7 h），将生长培养基吸出，清洗贴壁细胞（1×PBS），样品组：加入200 μL/孔，均含10%提取物（即浓度分别为4、8、16、24、32、40 mg/mL）生长培养基，对照组：加入200 μL/孔含10% PBS 生长培养基，空白组：加入200 μL/孔生长培养基（不接种细胞），每个梯度接种8 个平行孔。培养72 h 后将提取物吸出，清洗贴壁细胞（1×PBS），按照CCK-8 试剂盒进行操作，加入150 μL/孔CCK-8工作液（CCK-8:DMEM 按1:9 配制），培养80 min，每孔吸出120 μL 至新96 孔板的对应孔内，在450 nm处测定其吸光度。增殖抑制率的计算参照1.2.3.1 DPPH 自由基清除率计算公式，结果以药食两用植物提取物的半最大效应浓度（即MC-38 细胞增殖抑制率达到50%的提取物浓度）EC50（平均值±SD）mg/mL表示。

1.3 数据处理

实验均为三次平行，数据结果以平均值±SD 表示，作图用Sigmaplot 10.0 软件，数据处理用SPSS 22.0 统计软件，平均值的差异显著性用one-way ANOVA 的Duncan 检验，P＜0.05 视为有显著性差异；相关性分析用双变量相关进行分析，P＜0.05 为显著性相关。

2 结果与分析

2.1 广东药食两用植物的总黄酮含量

10 种广东药食两用植物的总黄酮含量如图1 所示，其中高良姜的总黄酮含量（85.76±3.25 μmol CE/g DW）最高，布渣叶（50.66±2.29 μmol CE/g DW）次之，随后是橘红（17.00±0.59 μmol CE/g DW）。其它药食两用植物的总黄酮含量高低依次是陈皮（8.61±0.29 μmol CE/g DW）、藿香（8.59±0.41 μmol CE/g DW）、肉豆蔻（6.76±0.37 μmol CE/g DW）、益智仁（4.49±0.22 μmol CE/ g DW）、佛手（4.15±0.12 μmol CE/ g DW），沙姜（0.80±0.05 μmol CE/g DW）和龙眼肉（0.69±0.03 μmol CE/g DW）的总黄酮含量最低，两者之间无显著性差异（P＞0.05）。

图1 10 广东药食两用植物的总黄酮含量Fig.1 Total flavonoids contents of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.2 广东药食两用植物的总多酚含量

由图2 可见，10 种广东药食两用植物中高良姜的总多酚含量（226.26±9.17 μmol GAE/g DW）最高，其次是橘红（191.24±7.05 μmol GAE/g DW），再者是布渣叶（138.85±2.25 μmol GAE/g DW）。其它药食两用植物的总多酚含量高低依次是陈皮（62.03±2.83 μmol GAE/g DW）、佛 手（40.34±2.61 μmol GAE/g DW）、藿香（25.04±1.86 μmol GAE/g DW）、龙眼肉（24.57±1.15 μmol GAE/g DW）、肉豆蔻（19.15±0.76 μmol GAE/g DW）、益智仁（15.45±1.22 μmol GAE/g DW），沙 姜（7.52±0.67 μmol GAE/g DW）的总多酚含量最低。

图2 10 种广东药食两用植物的总多酚含量Fig.2 Total polyphenols content of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.3 广东药食两用植物的抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基的清除活性 10 种广东药食两用植物清除DPPH 自由基的EC50值见图3，其中高良姜（EC50为0.058±0.001 mg/mL）清除DPPH 自由基活性最强，其次是布渣叶（0.164±0.008 mg/mL），再者是橘红（0.525±0.024 mg/mL）。其它药食两用植物清除DPPH 自由基活性的强弱依次是佛手（0.759±0.045 mg/mL）、藿香（0.793±0.053 mg/mL）、肉豆蔻（0.964±0.032 mg/mL）、陈皮（1.001±0.086 mg/mL）、益智仁（1.467±0.115 mg/mL）、龙眼肉（1.534 ±0.131 mg/mL），沙姜（7.336±0.310 mg/mL）的清除DPPH 自由基活性最弱。

图3 10 种广东药食两用植物的清除DPPH 自由基EC50 值Fig.3 Scavenging DPPH free radical EC50 of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.3.2 羟自由基的清除活性 10 种广东药食两用植物的羟自由基清除率如图4 所示，其中沙姜（羟自由基清除率为92.42%±1.03%）、益智仁（90.85%±1.28%）、肉豆蔻（90.13%±0.74%）清除羟自由基的活性最强，三者之间无显著性差异（P＞0.05）。其次是布渣叶（82.37%±1.18%），再者是龙眼肉（79.98%±0.83%）。其它药食两用植物清除羟自由基活性的强弱依次是橘红（74.72%±1.04%）、高良姜（70.47%±2.13%）、藿香（63.17%±1.80%）、佛手（35.18%±1.18%），陈皮（21.49%±0.98%）的清除羟自由基活性最弱。

图4 10 种广东药食两用植物的羟自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.4 广东药食两用植物的抗增殖活性

10 种广东药食两用植物抗MC-38 细胞增殖活性的EC50值见图5，其中陈皮（EC50值为1.29±0.08 mg/mL）和高良姜（EC50值1.93±0.10 mg/mL）抗增殖活性最强，两者无显著性差异（P＞0.05）。其次是布渣叶（2.62±0.14 mg/mL），再者是肉豆蔻（5.21±0.36 mg/mL），其它药食两用植物的抗增殖活性强弱依次是橘红（8.00±0.33 mg/mL）、藿香（8.46±0.44 mg/mL）、沙姜（10.23±0.58 mg/mL）、益智仁（12.99±0.41 mg/mL）、佛手（18.43±0.74 mg/mL），龙眼肉（23.32±0.82mg/mL）的抗增殖活性最弱。

图5 10 种广东药食两用植物的抗增殖活性EC50 值Fig.5 Antiproliferative activities EC50 of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

2.5 广东药食两用植物功效与含量的相关性

由表1 可以看出，10 种广东药食两用植物的DPPH 自由基清除活性与其总黄酮含量之间的正相关性显著（r=0.383，P＜0.05），其中总黄酮含量相对较低的佛手清除DPPH 自由基的活性较高。植物活性功效虽然受剂量效应的影响，但植物成分种类、协同作用以及构效关系对植物功效的影响仍然占重要地位[28-30]。因此，不能单从活性物质含量来推测药食两用植物相关功效活性的强弱。抗增殖活性与其总黄酮含量之间的正相关性极显著（r=0.560，P＜0.01），但陈皮的总黄酮含量相对较低，其抗MC-38 细胞增殖活性却最高。10 种广东药食两用植物的DPPH 自由基清除活性与其总多酚含量之间的正相关性显著（r=0.439，P＜0.05），其中陈皮的总多酚含量相对较高，但其清除DPPH 自由基的活性偏低；抗增殖活性与其总多酚含量之间的正相关性极显著（r=0.498，P＜0.01），其中陈皮和肉豆蔻的总多酚含量相对较低，其抗MC-38 细胞增殖活性却较高，总黄酮含量相对较高的橘红和佛手，其抗MC-38 细胞增殖活性的活性却偏低。10 种广东药食两用植物的羟自由基清除活性与其总黄酮和总多酚含量之间的相关性均不显著（r=0.059，P＞0.05；r=-0.308，P＞0.05）。

表1 10 种广东药食两用植物活性物质含量与功效的相关性Table 1 Correlation between content and efficacy of 10 kinds of Guangdong medicinal and edible plant

3 结论

在10 种广东药食两用植物中，总黄酮含量最高为高良姜（85.76±3.25 μmol CE/g DW），含量最低为沙姜（0.80±0.05 μmol CE/g DW）和龙眼肉（0.69±0.03 μmol CE/g DW），两者之间无显著性差异（P＞0.05）；总多酚含量最高为高良姜（226.26±9.17 μmol GAE/g DW），含量最低为沙姜（7.52±0.67 μmol GAE/g DW）；清除DPPH 自由基活性最强的高良姜（EC50为0.058±0.001 mg/mL），活性最弱为沙姜（EC50为7.336±0.310 mg/mL）。清除羟自由基活性最强为沙姜、益智仁和肉豆蔻（清除率分别为92.42%±1.03%、90.85%±1.28%、90.13%±0.74%），三者之间无显著性差异（P＞0.05），活性最弱为陈皮（清除率为21.49%±0.98%）。抗MC-38 细胞增殖活性最强为陈皮（EC50值为1.29±0.08 mg/mL）和高良姜（EC50值为1.93±0.10 mg/mL），两者无显著性差异（P＞0.05），活性最弱为龙眼肉（EC50值为23.32±0.82 mg/mL）。

10 种广东药食两用植物的DPPH 自由基清除活性与其总黄酮和总多酚含量之间正相关性均显著（相关系数分别为r=0.383，P＜0.05；r=0.439，P＜0.05）；抗MC-38 细胞增殖活性与其总黄酮和总多酚含量之间正相关性均极显著（r=0.560，P＜0.01；r=0.498，P＜0.01）；羟自由基清除活性与其总黄酮和总多酚含量之间相关性均不显著（r=0.059，P＞0.05；r=-0.308，P＞0.05）。药食两用植物的活性功效虽有剂量效应，但还受到其成分种类、协同作用以及构效关系等的影响。