基于GC-IMS 技术分析不同酵母菌发酵蓝莓酒风味物质

严红光，张建炀，霍羽佳，袁 玮

（1.凯里学院大健康学院，贵州凯里 556001；2.黔东南苗族侗族自治州食品药品检验检测中心，贵州凯里 556001；3.山东海能仪器股份有限公司，山东济南 250001）

蓝莓为杜鹃花科（Ericaeae）越橘属（VaccimiumL.）灌木，原产加拿大和北美交界处，引种至我国已有30 多年历史，目前已在10 多个省广泛栽培，其中贵州省麻江县栽培面积接近十万亩[1]。蓝莓果实富含多酚、花色苷、适宜的糖酸比，已经大量用于酿造果酒[1-4]。果酒风味物质是构成果酒典型性和决定品质等级的关键因素之一，主要受到原料、发酵和陈酿三大因素影响[3]。其中酵母菌作为果酒酿造的灵魂，在发酵过程中大量形成酯类、高级醇类、醛类、酮类等风味物质，能够显著影响果酒的风味特征[2-3]。

目前用于挥发性风味物质研究的技术手段主要包括气质联用法（GC-MS）、电子鼻法、气相色谱嗅觉测量法（GC-O）等[5]。其中气质联用法存在耗时长、处理程序复杂、碎片峰解谱难等缺点，电子鼻法虽然操作简单，重现性好，但是存在精度较低、传感器易漂移等缺点，GC-O 法则存在重复性、稳定性不高等缺点[6]。气相色谱离子迁徙谱（GC-IMS）方法具有样品处理简单、最大程度保留自身风味物质、高分辨率等特点[5]。目前GC-IMS 技术已经在食用油掺假检测[7-8]、烟熏食品[5]和干燥食品[9]加工、保藏期间的风味变化[10-11]以及白葡萄酒的分类[12]和异味[13]检测、酵母菌发酵过程中葡萄酒风味特征动态变化[14]等方面取得较好应用。

由于商业活性干酵母具有启酵迅速、发酵性能稳定，保藏和使用方便等优势，在酿酒工业上获得大量推广。有研究利用GC-MS 和感官评价发现不同商业酿酒酵母发酵蓝莓果酒后香气特征差异显著[15-19]。Liu 等[20]利用GC-MS 研究了9 种商业活性干酵母发酵龙眼果酒，发现影响香气特征最主要的因素是酵母菌种类，其次是龙眼果汁含量和发酵后酒精含量。Yang 等[21]利用GC-MS 分析3 种商业酿酒酵母发酵砀山梨果酒后发现，挥发性物质总量、醇、酯类化合物含量和组成随菌种改变而发生变化。Florin 等[22]根据筛选的18 种挥发物质检测结果建立指纹图谱，有效识别出8 种商业活性干酵母发酵葡萄酒香气特征差异。Liu 等[23]对2 个南高种群蓝莓品种果实进行酒精发酵，GC-MS 分析发现萜类香气物质部分水解后导致其相对含量减少。商业活性酿酒干酵母是经过长期选育获得，具有优良发酵特性，同时不同菌种分别具有增香、酒精发酵停滞后重新启动发酵、吸附色素等功能。对其进行果酒发酵后分析其挥发性物质代谢特征，有利于指导筛选适宜酿酒酵母菌株资源。本文选择四种不同来源商业活性干酵母，利用近年来出现的GC-IMS 技术分析其发酵中国南方地区普遍栽培的兔眼种群(Vaccinum ashei)杰兔蓝莓(Premier)酿造果酒挥发性物质组分，以期为后续酿酒酵母筛选工作，拓展GC-IMS 新技术应用范围，加深对蓝莓果酒风味物质特征认识，及改进蓝莓果酒香气特征品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杰兔蓝莓成熟果实 贵州麻江中国南方蓝莓繁育基地；Angel ADT 活性干酵母 湖北安琪酵母股份有限公司；Lalvin K1、Uvaferm 43、Lalvin DV10活性干酵母 法国拉曼公司；氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠 分析纯，西陇化工有限公司；亚硫酸钠法国拉曼公司；蔗糖 市购。

FlavourSpec®风味分析仪配备自动顶空进样器德国G.A.S.公司；CP214 万分之一电子天平 美国OHAUS 公司；bn/qnyz-20 气囊压榨机 河北博酿酿酒设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样酒制备 参考课题组前期方法[1]进行，选择杰兔蓝莓成熟果实，经0.8 MPa 气囊压榨取汁，加二氧化硫50 mg/L，4 ℃静置8 h 后用蔗糖调整总糖含量为220 g/L，添加磷酸二氢铵150 mg/L、添加碳酸氢钾至pH 为3.3，置入2.5 L 带水封果酒发酵瓶，装载量80%，分别接种0.1%法国拉曼K1、UV43、DV10活性干酵母和安琪ADT 活性干酵母，于25 ℃进行酒精发酵，四种活性干酵母酿造的蓝莓果酒依次编号为K、UV、DV 和A。残糖停止下降后立即分离酒脚，补加二氧化硫30 mg/L，99.5%装罐量陈酿30 d后取样待测。三次重复试验。

1.2.2 基本理化指标测定 酒精度、总糖、总酸、挥发酸、干浸出物测定按照GB/T 15038-2006[24]进行。

1.2.3 GC-IMS 测定挥发性成分 样品预处理：取1 mL 酒样置于20 mL 顶空瓶中，孵化转速500 r/min，45 ℃孵育15 min 后进样。

GC-IMS 分析条件：色谱柱WAX 30 m×0.53 mm ID，柱温60 ℃，载气/漂移气均为≥99.999%氮气，IMS温度45 ℃，分析时间30 min。自动进样体积100 μL，进样针温度50 ℃。

气相色谱条件：0～2 min：漂移气150 mL/min，载气2 mL/min；2～20 min：漂移气150 mL/min，载气2 mL/min 提升至100 mL/min；20～30 min：漂移气150 mL/min，载气100 mL/min。

1.3 数据处理

利用GC-IMS 仪器配置的LAV (Laboratory Analytical Viewer)软件查看分析谱图，Reporter 插件进行二维和三维谱图差异比较，GC × IMS Library Search 软件利用内置NIST 数据库和IMS 数据库对挥发性物质进行定性分析，Gallery Plot 插件进行不同样品间挥发性有机物含量差异比较，Dynamic PCA 插件进行主成分分析。

2 结果与分析

2.1 四种商业活性干酵母发酵蓝莓果酒基本理化指标

表1 为四种商业活性干酵母发酵杰兔蓝莓果酒三次重复实验样品基本理化指标测定结果。从表1可见：蓝莓果酒酒精含量范围为10.4%～11.0%，总糖含量为1.8～11.5 g/L，干浸出物含量为16.6～17.3 g/L，总酸含量范围为7.5～8.2 g/L，挥发酸含量范围为0.2～1.1 g/L。K、A、DV 三个样酒彼此间酒精度、干浸出物、总酸差异不显著，残留总糖差异显著（P＜0.05）。残糖和酵母菌酒精转化率有关，残糖越高，酒精转化率越低[18]。UV 活性干酵母发酵获得的蓝莓果酒中酒精度、干浸出物、总糖、挥发酸含量与DV 样酒差异显著（P＜0.05）；总酸含量与DV 差异不显著，但是与K、A样酒差异显著（P＜0.05）。相对于其它三种酵母，UV 43 活性干酵母酿造蓝莓果酒酒精度含量显著较低（P＜0.05），而总糖、总酸和挥发酸含量相对较高。这可能是由于UV 43 酵母属于发酵重启酵母，适宜在酒体发酵后期含有较低含量氮源、较高含量乙醇和C8、C10 饱和脂肪酸带来的协同抑制作用下，补充加入酒体，发酵残糖，产酒精效率较低。试验结果预示，UV 43 重启酵母不太适合完成整个酒精发酵过程，更适宜后期补加发酵。

表1 四种酵母菌发酵蓝莓果酒基本理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of blueberry wines fermented with four yeasts

2.2 蓝莓果酒挥发性成分GC-IMS 定性分析

利用GC-IMS 分析四种商业活性干酵母发酵蓝莓果酒挥发性成分，根据物质峰保留时间，迁移时间和峰强度生成三维数据谱图。由于三维图组间差异观察较困难，因此将其投影获得二维俯视图。图1显示了四种酵母菌发酵蓝莓果酒后全部挥发性物质二维图谱。

图1 四种酵母菌发酵蓝莓果酒GC-IMS 二维谱图及定性结果Fig.1 GC-IMS two-dimensional spectrum and qualitative results of blueberry wines fermented with four yeasts

从图1 可见，图中标注圆圈位置处UV 样品挥发性物质含量最高，DV、A 和K 样品含量依次逐步减少。图1 中标注三角形和矩形位置处K 样品挥发性物质含量高于其它三个样品，这说明四种活性干酵母K、A、DV、UV 发酵蓝莓酒后具有不同的挥发性物质组分特征。

为进一步分析主要挥发性物质变化情况，根据每种挥发性物质保留时间和迁徙时间，使用正酮C4～C9外标计算每种化合物保留指数，与GCIMS 内置NIST 数据库和IMS 数据库进行定性比对分析。从图1 中4 种蓝莓果酒样品均识别出26 种挥发性物质组分，结果见表2。图1 和表2 中物质编号均一致。由于相关数据库正在完善中，因此图1中部分挥发性物质未能识别。

从表2 可知，蓝莓果酒中识别出的26 种挥发性物质主要为酯类、醇类物质，其中酯类物质13 种，醇类物质6 种，酸类物质3 种，醛类物质2 种，酮类物质2 种。有研究[15-18]利用GC-MS 分析了蓝莓果酒中挥发性物质组分，发现主要是醇类和酯类化合物，与本研究结论一致。如盖禹含等[2]利用HP-SPMEGC-MS 技术分析三种酿酒酵母菌发酵北陆品种蓝莓，共识别出76 种挥发性物质，除了醇类、酯类化合物，还识别出占总峰面积比2.31%的7 种萜烯类化合物。这可能是由于GC-IMS 分析过程中，样品处理没有SPME 吸附过程以及仪器配套使用的数据库尚有待进一步完善，图1 中部分未知挥发性物质未能被定性识别有关。曹雪丹[4]和Liu 等[23]分别利用GC-MS 分析南高种群蓝莓果实发酵前后挥发性物质差异，主要是醇类和酯类化合物，而萜类化合物在蓝莓酒发酵后受水解作用显著减少。这可以部分解释样酒GC-IMS 检测结果未能识别出作为品种香重要组成的萜类化合物。

表2 二维谱图中部分挥发性物质定性结果Table 2 Qualitative results of some volatile substances in the two-dimensional spectrum

2.3 蓝莓果酒挥发性成分指纹图谱分析

利用GC-IMS 配置的Gallery Plot 插件可以进一步比较四种酵母菌发酵蓝莓酒样品中挥发性有机物含量差异。根据识别出的挥发性有机物含量和组成，插件构建出指纹图谱（图2）。从图中可以直观比较出每种样品的完整挥发性有机物信息以及样品之间挥发性有机物的差异。

由图2 可知：A 区域为酯类物质，其种类远多于醇类、醛类结构化合物。四种样酒中普遍含量较高的包括甲酸乙酯、乙酸乙酯、丙酸乙酯、异丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丁酯。但是乳酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯、己酸乙酯、己酸乙酯二聚体、辛酸乙酯在K 和DV 样酒中含量显著高于A 和UV 样酒。酒精发酵过程中醇与游离有机酸反应形成酯类物质，具有相对较低的阈值和令人愉悦的果味，花香或草本气味[25]。酯类物质对蓝莓果酒香气特征贡献最显著[15]。Yang 等[21]也发现不同酵母菌种发酵砀山梨后酯类物质组成差异显著，说明酵母菌种的选择影响果酒的主要香气特征。

图2 四种酵母菌发酵蓝莓果酒挥发性物质指纹图谱Fig.2 Volatile substances fingerprint of blueberry wines fermented with four yeasts

B 区域为醇类物质，四种样酒均含有乙醇、丙醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-1-丁醇、1-丁醇、1-己醇，含量稍有差别。DV 样酒含有相对较高的1-丁醇，属于高级醇，有利于蓝莓酒醇香的形成。由于K 和DV 样酒酯/醇比例高于A 和DV 样酒，因此K 和DV 活性干酵母酿造蓝莓果酒偏向酯香型，而A 和DV 活性干酵母酿造蓝莓果酒偏向醇香型。郭成宇等[3]利用不同酿酒酵母发酵获得的蓝莓酒也分别呈现出醇香或酯香特征，与本研究结论一致。文献[1-2,15]利用SPME-GC-MS 分析出蓝莓果酒样品中最主要的醇类物质成分是3-甲基-1-丁醇，Chen 等[26]利用HS-GC-IMS 分析辣椒干燥过程中挥发性物质组分，识别出3-甲基-1-丁醇。本文4 种酵母菌发酵样酒均未能检测出3-甲基-1-丁醇，这可能是由于蓝莓产地不同或栽培管理方式差异导致。

C 区域为酸类物质，四种样酒均含有乙酸、2-甲基丙酸、2-甲基丁酸，但是乙酸、2-甲基丙酸在UV 样酒中含量较高，2-甲基丁酸在K 样酒中含量较高。过量的乙酸会导致出现不愉快的气味和挥发酸超标[18]。但是适量的酸有助于减缓酯类物质的水解反应[21]。

四种酵母菌发酵样酒中检测到乙偶姻、丙酮、苯甲醛、乙醛等挥发性物质。其中乙偶姻在A 样品中含量较高，可产生令人愉快的奶油香味。适量的酮类和醛类挥发性物质有助于丰富蓝莓果酒的香气特征。

2.4 蓝莓果酒挥发性成分相似度分析

根据对特征挥发性物质离子峰的保留指数、迁移时间数据、各样品中物质峰体积数据综合分析得出相似度分析表（表3）。四种酵母菌酿造蓝莓酒样品组内相似度较高，为85%～94%。组间相似度相对较低，其中Angel ADT 与Lalvin K1 发酵蓝莓果酒样品之间相似度仅有60%，说明不同活性干酵母菌种的选择能够明显影响蓝莓果酒风味特征。

表3 四种酵母菌发酵蓝莓果酒样品相似度分析Table 3 Similarity analysis of blueberry wines fermented with four yeasts

2.5 蓝莓果酒挥发性成分主成分分析

为了直观分析四种活性干酵母发酵蓝莓果酒风味物质差异，使用Dynamic PCA 插件程序制作样酒主成分分析图，结果如图3。PC1 和PC2 的贡献解释了总变异的70%，且四种酵母菌发酵蓝莓果酒样品能很好地分离，证明样酒的特征风味物质具有一定差异。Lalvin K1 活性干酵母发酵样酒K 聚集在主成分分析图右侧，Lalvin DV10 活性干酵母发酵样酒DV 聚集在图上方，Angel ADT 活性干酵母发酵样酒A 聚集在图左下侧，Lalvin Uvaferm 43 活性干酵母发酵样酒UV 聚集在图左上侧。由PCA 结果可知，四种酵母发酵的蓝莓酒风味各不相同，其中A 与UV 样酒的相似度稍高。

图3 四种酵母菌发酵蓝莓果酒主成分分析结果Fig.3 Principle component analysis of blueberry wines fermented with four yeasts

3 结论

应用GC-IMS 技术分析了四种商业活性干酵母酿造的蓝莓果酒中26 种挥发性物质，构建的指纹图谱信息和主成分分析结果表明，酿酒酵母菌种明显影响果酒的酯类、醇类、乙偶姻等香气物质组分，其中Angel ADT 酵母发酵后乙偶姻含量较高。研究结果为后续深入认识酿酒酵母调控蓝莓果酒风味特征物质提供依据。由于GC-IMS 的样品前处理尚未应用SPME 技术及内置NIST 数据库有待完善，其识别出的挥发性物质种类较GC-MS 分析结果相对较少。蓝莓样酒中未能识别出萜类品种香和3-甲基-1-丁醇发酵醇香物质。后续将结合SPME-GC-MS 等技术，进一步完善蓝莓果酒挥发性物质指纹图谱，开发其应用价值。