响应面法优化超临界CO2 萃取汉麻叶精油工艺

田 媛，孙宇峰，张正海，张 旭，石 雨，董 艳，崔宝玉，张晓艳，韩承伟，魏连会，杨庆丽，高宝昌

（黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆 163319）

汉麻又称工业大麻(Cannabis sativaL.），张建春等[1]根据英文“Hemp”音译而来。汉麻属于无毒品利用价值的大麻类型[2]，其四氢大麻酚（THC）含量低于0.3%[3]，汉麻叶含有多种生理活性成分，如萜类、酚类、黄酮类、生物碱等[4-7]。在不同的生长时期，汉麻叶占植株比例不同，在生长旺盛时期和后期叶子占整个植株质量分别为25%和8%～14%[8]。

目前，植物精油的提取方法有很多种，水蒸气蒸馏法是最常见的方法，其提取工艺设备简单，但其提取效率低、提取过程能耗高[9-10]。超临界二氧化碳（SC-CO2）萃取是在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小不同的成分依次萃取出来，是一种可持续的绿色技术，可用于提取含高芳香族化合物的高纯度油脂[11]，具有操作工艺简单、萃取时间短、萃取温度低、萃取效率高、无溶剂残留污染等特点[12-13]。目前，很多研究领域都有用到此技术，尤其在植物精油提取方面得到较好的应用，如对沉香[14]、荔枝果核[15]、绿薄荷[16]、茉莉花蕾[17]、虎掌菌[18]等精油的提取，还有很多其他植物精油提取也应用到此技术，以上充分说明了此技术在精油提取方面具有优势。

目前，采用超临界CO2萃取技术在汉麻叶精油的提取方面还少见报道，所以本项目以提高汉麻叶的附加价值为出发点，推动汉麻叶资源的深度开发利用为目的，利用此技术对汉麻叶进行汉麻叶精油的提取，以单因素实验为基础，将萃取率作为评价指标，对汉麻叶精油的提取工艺进行响应面分析，从而获得最佳提取工艺。以期为汉麻叶精油的开发利用提供科学依据，为全方位利用汉麻植株奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

汉麻叶 采自黑龙江省科学院大庆分院实验田；CO2（CO2纯度≥99.99%）沈阳市信利盛兴气体公司。

SFT-10 型超临界CO2萃取装置 Erie 赛普泰克有限公司；FW400A 型高速万能粉碎机 常州市伟嘉仪器制造有限公司；PTX-FA110 电子天平 福州华志科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 汉麻叶预处理 采摘成熟期汉麻叶，将采摘后的汉麻叶洗干净后阴干，粉碎过筛。

1.2.2 萃取工艺流程 将阴干的汉麻叶→粉碎→过30 目筛→汉麻叶粉末30 g→入萃取釜→CO2萃取→汉麻叶精油

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 萃取压力对萃取率的影响 固定萃取温度为50 ℃，萃取时间为3 h，CO2流量为13 mL/min时，分别考察萃取压力为15、20、25、30、35 MPa 时对精油萃取率的影响，按照1.2.2 萃取流程萃取汉麻叶精油，并计算萃取率。

1.2.3.2 萃取温度对萃取率的影响 固定萃取压力为25 MPa，萃取时间为3 h，CO2流量为13 mL/min时，分别考察萃取温度为40、45、50、55、60 ℃时对精油萃取率的影响，按照1.2.2 萃取流程萃取汉麻叶精油，并计算萃取率。

1.2.3.3 萃取时间对萃取率的影响 固定萃取压力为25 MPa，萃取温度为50 ℃，CO2流量为13 mL/min时，分别考察萃取时间为2、2.5、3、3.5、4 h 时对精油萃取率的影响，按照1.2.2 萃取流程萃取汉麻叶精油，并计算萃取率。

1.2.3.4 CO2流量对萃取率的影响 固定萃取压力为25 MPa，萃取温度为50 ℃，萃取时间为3 h 时，分别考察CO2流量为9、11、13、15、17 mL/min 时对精油萃取率的影响，按照1.2.2 萃取流程萃取汉麻叶精油，并计算萃取率。

1.2.4 响应面优化试验 在单因素实验的基础上，以汉麻叶精油的萃取率（Y）为评价指标，X1、X2、X3、X4为自变量，试验因素及水平设计见表1。

表1 Box-Behnken 试验因素与水平设计Table 1 Factors and levers in the Box-Behnken experimental design

1.2.5 汉麻叶精油萃取率计算 公式[19]如下：

萃取率（%）=汉麻叶精油质量（g）/汉麻叶粉末质量（g）×100

1.3 数据处理

根据Box-Behnken 中心组合试验设计原理[20]，结合单因素实验结果，选取萃取压力（X1）、萃取温度（X2）、萃取时间（X3）、CO2流量（X4）4 个因素为自变量，以汉麻叶精油萃取率（Y）为响应值，运用Design -Expert 8.0.6 软件对试验数据进行回归分析并得到最佳提取工艺参数。采用SPSS17.0 对数据进行Duncan 多重比较分析，图表采用GraphPad Prism 5 绘制。每组实验重复3 次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 萃取压力对萃取率的影响 萃取压力改变超临界CO2的密度，从而影响精油萃取率[21]，由图1 可知，增大萃取压力，精油萃取率也随之增大，当压力为30 MPa 时，萃取率达到最大为0.271%，但压力继续升高到35 MPa 时，萃取率反而降为0.261%。因此，30 MPa 为最佳萃取压力。

图1 萃取压力对汉麻叶精油萃取率的影响Fig.1 Influence of extraction pressure on the yield of essential oil of hemp leaves

2.1.2 萃取温度对萃取率的影响 升高温度可使分子热运动加快，继而加大溶质的扩散速度[19]。由图2可见出，随着萃取温度升高，精油萃取率增大，在50 ℃时萃取率为0.266%，达到最大。当继续升高萃取温度时，精油萃取率反而降低，因此，50 ℃为最佳萃取温度。

图2 萃取温度对汉麻叶精油萃取率的影响Fig.2 Influence of extraction temperature on yield of essential oil from hemp leaves

2.1.3 萃取时间对萃取率的影响 由图3 可知，萃取时间在2～3.5 h 时，汉麻叶精油萃取率随着萃取时间的增加而增大，3.5 h 时萃取率最大，为0.272%。当萃取时间继续变长时，萃取率反而下降，可能是过长的萃取时间使体系中其他色素和成分也被萃取出来[22]，因此，萃取时间选3.5 h 为宜。

图3 萃取时间对汉麻叶精油萃取率的影响Fig.3 Influence of extraction time on the yield of essential oil from hemp leaves

2.1.4 CO2流量对萃取率的影响 由图4 可知，随着CO2流量的增大，汉麻叶精油萃取率也随之增大，当CO2流量为13 mL/min 时，精油萃取率达到最大，为0.266%，再继续增大时，萃取率稍有下降。推测适当增大CO2流量有利于精油的萃取，但流量过大，CO2流体与汉麻叶粉末接触时间减少，对精油的提取不利[23]。因此，CO2流量为13 mL/min 为宜。

图4 CO2 流量对汉麻叶精油萃取率的影响Fig.4 Influence of CO2 flow rate on yield of essential oil of hemp leaf

2.2 响应面优化设计实验

根据单因素实验结果，进行汉麻叶精油提取工艺响应面优化试验，结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of the Box -Behnken test

2.3 建立数学模型及方差分析

对表2 的结果进行多元回归拟合分析，得到模型回归方程，如下所示：

方差分析结果见表3。此模型显著（P＜0.05），模型失拟项不显著（P＞0.05），信噪比为78.682，大于4，R2=0.9983，调整决定系数Radj2为0.9966，可诠释99.66%响应值的变化。Rpred2为0.9917 与Radj2相接近，结果表明误差小，拟合度好，可用此模型分析与预测汉麻叶精油的提取工艺条件[24,25]。根据表3 中F值可知，影响萃取率大小的因素依次为：X3＞X4＞X1＞X2。此外，通过P值可知，X1、X3、X4、X12、X22、X32、X42对精油萃取率有极显著影响（P＜0.01），X2、X1X3对精油萃取率有显著影响（P＜0.05）。

2.4 响应面分析及条件优化

图5 表示取X1、X2、X3、X4任意两个变量，精油萃取率受其余两个变量的影响情况[26]。响应曲面越曲折，交互作用越强。交互作用显著得是X1与X3，其他两个变量两两交互作用都不显著，此结果与表3 结果相同。

图5 两因素交互作用对精油萃取率的影响Fig.5 Interaction of two factors on extraction rate of essential oil

表3 回归分析结果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.5 最佳工艺条件验证

通过响应面分析，得到最佳汉麻叶精油提取工艺条件为萃取压力28.89 MPa、萃取温度49.15 ℃、萃取时间3.41 h、CO2流量12.87 mL/min，汉麻叶精油理论萃取率为0.281%。通过验证实验来证明模型预测结果的可靠性，根据萃取设备的实际可操作性，将工艺条件改为萃取压力29 MPa、萃取温度49 ℃、萃取时间3.4 h、CO2流量为13 mL/min。按照上述修改后的工艺条件进行了精油的提取，做了三组平行实验，平均实际萃取率为0.283%，基本等同与理论值0.281%，预测值与真实值的实际偏差为-0.71%，二者具有良好的拟合性。

3 结论

本研究通过单因素实验和响应面法优化汉麻叶精油的提取工艺，方差分析结果表明，在影响汉麻叶精油萃取率因素方面，萃取时间＞CO2流量＞萃取压力＞萃取温度。结合提取工艺的实际可操作性和便利性，最后将工艺条件改为萃取压力29 MPa、萃取温度49 ℃、萃取时间3.4 h、CO2流量为13 mL/min，得到的实际萃取率是0.283%，与理论值0.281%相接近，预测值与真实值的实际偏差为-0.71%，二者具有良好的拟合性，说明基于响应面法所得的优化提取工艺参数准确可靠，具有实用价值。

目前，汉麻叶在我国的深度应用开发相对较弱，在精油提取方面很少，主要集中在对汉麻叶中大麻二酚等大麻酚类成分的提取和应用方面，因此本项目通过对汉麻叶精油提取工艺的优化，建立简单、高效、绿色的汉麻叶精油提取工艺，为其生产、加工提供理论参考。