鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联油乳灭活疫苗免疫后备鸽抗体水平研究

林明星 余见栋 吴志远

1.浙江省平阳县畜牧兽医管理中心，浙江平阳325400；2.浙江省平阳县农业农村局 浙江平阳325400

鸽新城疫又称鸽瘟或鸽Ⅰ型副黏病毒（Pigeon paramyxovirus I，PPMV-I）病，是一种由禽I 型副黏病毒引起的、流行于鸽群的高度接触性急性传染病，且普遍存在于各种鸽群（肉鸽、信鸽和赛鸽）中[1]。该病主要以肠炎、严重腹泻和神经症状为特征，传播迅速，发病率和死亡率高，常给鸽场造成严重的经济损失。由于鸽属珍稀家禽，市场对鸽专用的鸽副黏病毒疫苗需求量较少，同时根据鸽I 型副黏病毒与鸡新城疫病毒同为副黏病毒，有相似的免疫原性，据杨秀环等[2]报道，用鸡的新城疫弱毒疫苗和灭活疫苗对鸽进行免疫，可有效预防和控制鸽新城疫的感染和传播。生产上常借用鸡新城疫疫苗进行免疫预防。禽流感是由A 型流感病毒（Avianin-fluenzavirus，AIV）引起的一种以禽类感染为主的传染性疾病[3]，根据其不同的致病性可分为低致病性禽流感和高致病性禽流感。在我国，低致病性禽流感以H9亚型为主，具有流行范围广、传播能力强、感染发病率高等特点。据相关资料显示，H9 亚型禽流感可引发禽类呼吸道感染、产蛋量等生产性能下降，继发其他疫病，严重的还会导致急性全身致死性疾病[4]。禽流感不仅感染多种家禽及鸟类，严重危害养禽业的发展，还可以跨越种属屏障直接感染人[5]，具有重要的经济和公共卫生意义。大量研究[6]和实践证明，应用疫苗的免疫接种可有效预防和控制这2 种疾病的发生与流行，但鸽体对这些疫苗免疫应答的系统研究报道较少。为探讨鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗对鸽的免疫效果，对比不同免疫程序下的抗体消涨情况，笔者开展了疫苗不同免疫程序对鸽免疫效果试验，免疫后定期检测其血清抗体的效价，了解血清抗体消长规律及其相互关系，以期为制定科学的免疫程序提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验动物。试验鸽为60日龄后备鸽，未进行新城疫苗免疫、临床健康的美国白羽王鸽高代杂交种，共24 对（48 只）。

2）试验疫苗。鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗，购自青岛易邦生物工程有限公司。

3）主要试剂。血凝抑制试验用鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）病毒抗原及标准阳性血清，购自青岛易邦生物工程有限公司、哈尔滨兽医研究所，经HA试验检测效价后，配成4 个血凝单位抗原备用；红细胞悬液按常规方法制备，用PBS 配成1%鸡红细胞悬液，4 ℃保存备用；阿氏液、磷酸盐缓冲液（PBS），按相关方法自行配制，4 ℃冰箱保存备用。

4）仪器设备。96 孔V 型微量板、微量移液器（配滴头）、微型震荡器、温箱等。

1.2 方 法

1）分组及免疫。后备鸽采血检测其新城疫和禽流感原有抗体水平后，将整个试验鸽群分成A、B组，每组24 只，每对1 笼，常规饲养。A 组采用鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗0.4 mL肌注免疫，隔21 d 加强免疫1 次；B 组采用鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗0.4 mL 肌注免疫1 次。

2）样品收集。2 组试验鸽于免疫后第1 周、第3周、第5 周、第7 周、第9 周、第11 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分别进行翅下静脉采血，每组抽取10 羽，每羽采血1 mL，血液样品于室温放置30 min 后，再置4 ℃冰箱中30 min，室温下4 000 r/min 离心5 min，收集上清液于一新EP 管中。

3）检测方法。严格按照《GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术》《GB/T 18936-2003 禽流感诊断技术》规范采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验（微量法）检测。每次检测的抗体滴度以log2 值表示，得出不同时段抗体水平的平均滴度。

4）结果判定。新城疫、禽流感HI 抗体滴度≥5log2 判定为免疫合格。

2 结果与分析

2.1 新城疫

以不同的免疫方式接种鸡新城疫、禽流感（H9亚型）二联油乳灭活疫苗后抗体消长情况见表1，后备鸽产生的新城疫抗体滴度从2log2～9log2 不等。

表1 各试验组新城疫抗体检测结果（log2）

在免疫前及免疫后第1 周、第3 周、第5 周、第7 周、第9 周、第11 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分别采血进行新城疫HI 抗体滴度测定。A组相应的HI 抗体滴度平均值为0.13log2、4.83log2、7.50log2、8.42log2、8.75log2、7.67log2、7.25log2、6.78log2、6.27log2、6.09log2、5.73log2，其中抗体合格率在第1 周达75%，第3 周开始均为100%，结果显示A 组试验后备鸽在免疫1 周后，新城疫抗体水平显著上升，经二次免疫后抗体滴度在第7 周达峰值8.75log2 后逐渐下降，至第25 周抗体滴度平均值为5.73log2，抗体合格率为100%，免疫保护期可达180 d以上，且均匀度佳。B 组相应的HI 抗体滴度平均值为0.17log2、4.22log2、6.67log2、6.36log2、6.83log2、5.42log2、5.27log2、4.43log2、3.92log2、3.80log2、3.40log2，其中抗体合格率分别为56%、100%、91%、100%、83%、73%、52%、42%、30%、20%，结果显示B组试验后备鸽在免疫1 周后，新城疫抗体水平显著上升，在第3～7 周曲折达峰值6.83log2 后逐渐下降，至第13 周抗体滴度平均值降至免疫合格线（5log2）以下，同时抗体合格率小于70%，免疫抗体保护期约90 d。

2.2 禽流感

以不同的免疫方式接种鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗后抗体消长情况见表2，后备鸽产生的禽流感HI 抗体水平从2log2～10log2 不等。

表2 各试验组禽流感（H9）抗体检测结果（log2）

在免疫前及免疫后第1 周、第3 周、第5 周、第7 周、第9 周、第13 周、第17 周、第21 周、第25 周分别采血进行禽流感HI 抗体滴度测定。A 组相应的HI 抗体滴度平均值为3.50log2、7.42log2、9.25log2、9.83log2、9.58log2、9.08log2、8.09log2、8.09log2、8.00log2、7.91log2，其中抗体合格率维持在92%以上水平。结果显示A 组试验后备鸽在免疫1周后，禽流感的抗体水平显著上升，经二次免疫后抗体水平在第5 周达峰值9.83log2 后逐渐下降，至25 周抗体滴度平均值为7.91log2，抗体合格率为100%，免疫保护期可达180 d 以上，且均匀度佳。B组结果相应的HI 抗体滴度平均值为3.57log2、6.60log2、8.58log2、8.18log2、7.00log2、6.00log2、5.61log2、5.91log2、5.70log2、5.70log2，其中抗体合格率分别为90%、100%、100%、100%、83%、83%、82%、80%、80%。结果显示B 组试验后备鸽在免疫1周后，禽流感的抗体水平显著上升，在第3 周达峰值8.58log2 后逐渐下降，至第13 周降至6log2 以下。

3 讨 论

本研究使用鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳灭活疫苗对后备鸽群进行免疫试验，免疫后7 d产生抗体，单次免疫B 组新城疫、禽流感抗体在免疫后第3～7 周达峰值分别为6.83log2、8.58log2，抗体合格率为100%；A 组21 d 加强免疫后激发机体产生更高抗体水平，新城疫、禽流感抗体分别在免疫后第7 周和第5 周达峰值8.75log2、9.83log2，抗体合格率为100%。通过分析免疫抗体水平可知，在试验中不同免疫程序下鸽体对二联油乳灭活疫苗具有良好的免疫反应，二联油乳灭活疫苗能诱导出较高的新城疫和禽流感免疫抗体，表现出良好的抗原性和免疫效果，这与丁卫星等[7]研究结果相符。鸽型副黏病毒病与鸡新城疫病同为副黏病毒，有相似的免疫原性，可交叉免疫。有研究[8]显示，使用鸡新城疫活疫苗免疫鸽易因种间差异、个体、日龄和疫苗毒力等造成免疫不稳定。针对种鸽存栏期长、雏鸽自然孵化需哺喂、同舍乳鸽日龄差异大、乳鸽母源抗体参差不齐等现状，同时乳鸽免疫接种活疫苗其免疫效果易受母源抗体影响，而应用灭活疫苗影响较小。同时鸽场一旦使用弱毒疫苗，易发生病毒扩散，导致鸽场疾病迁延不断。根据本试验对鸽场使用灭活疫苗的免疫效果监测分析表明，灭活疫苗免疫后，抗体效价高、合格率高、整齐度好、免疫保护期长，试验中运用的鸡新城疫、禽流感二联油乳灭活疫苗为成熟的灭活疫苗[9]，对鸽安全稳定，具有无病毒扩散、不污染环境等优点，有利于鸽场新城疫疫病的净化，适于养鸽场推广应用。

单达聪等[10]研究报道，抗体效价上升的速度受免疫间隔时间的影响，免疫间隔14 d 的抗体水平明显高于免疫间隔7 d，其原因可能是免疫间隔时间过短时，鸽体完成初次免疫识别与应答等一系列生理生化反应的时间不足，导致二次免疫应答机制受阻，甚至导致免疫抑制。本试验中A 组二次免疫间隔时间为21 d，取得了较好的免疫效果。据杨秀环等[2]报道，使用鸡新城疫活疫苗和灭活疫苗联合免疫乳鸽及成鸽，乳鸽、成鸽针对鸡源和鸽源新城疫强毒分别攻毒后抗体保护临界值为5log2 和4log2；白军等[11]、李新生等[12]研究发现，使用鸡新城疫、禽流感（H9 亚型）二联油乳剂灭活疫苗免疫的SPF 鸡，当新城疫HI 抗体效价达到4log2 时，攻毒保护率为80%以上，当抗体水平≥5log2 时，攻毒保护率为100%；当禽流感HI 抗体效价达到5log2 时，攻毒保护率为80%以上，当抗体水平≥6log2 时，攻毒后保护率为100%，本试验中以抗体效价≥5log2判定为免疫合格。通过2 组不同免疫程序下后备鸽新城疫、禽流感的免疫抗体跟踪监测，A 组首免后7 d产生抗体，21 d 加强免疫后激发机体产生更高抗体水平，新城疫抗体在免疫后第7 周达峰值后逐渐下降，至免疫后25 周在5log2 以上；禽流感在免疫后第5 周达峰值后逐渐下降，至免疫后25 周在7log2以上，抗体合格率均达100%。B 组经一次免疫，免疫后7 d 产生抗体，新城疫抗体在免疫后第3～7 周曲折达峰值后逐渐下降，至第13 周降至5log2 以下，抗体合格率仅为52%；禽流感在免疫后第3 周达峰值后逐渐下降，至第13 周降至6log2 以下，抗体合格率仅为80%。从结果中可以看出，A 组首免后隔21 d 进行二免的鸽群，新城疫与禽流感抗体水平和整齐度均显著高于只进行一次免疫的B 组鸽群，免疫后6 个月仍可维持高抗体水平，可有效抵抗新城疫和禽流感的感染；只进行单次免疫的B组，新城疫抗体保护期仅维持了90 d，禽流感抗体也在免疫90 d 后降至6log2 以下。在实验室条件下，HI 抗体滴度在5log2 时攻毒保护率为80%以上，并不能100%抵御病毒的攻击，同时考虑到现在复杂的养殖环境和禽群个体的差异，建议在实际生产中应尽量保持更高的HI 抗体滴度，以确保能够完全抵御强毒的攻击。据此建议鸽场在实际生产中首次免疫至少进行2 次以上的疫苗免疫。本试验为新城疫、禽流感疫苗在实际应用过程中选择与运用提供了试验依据，为更加有效预防新城疫和禽流感奠定了基础。