响应面法优化西兰花种子中异硫氰酸酯的酶解制备工艺

2021-06-18弓小星王雅杰郝晓庆梁轩铭

食品工业科技 2021年10期

杨杜，弓小星，王雅杰，郝晓庆，梁轩铭，巩强，苏锐,

（1.中北大学化学工程与技术学院，山西太原 030051；2.山西省食品质量安全监督检验研究院，山西太原 030012）

癌症是威胁人类生命最严重的恶性疾病之一，治疗难度大，治疗癌症最有效的举措是控制其发生[1]。植物及其天然产物具有防癌抗癌的潜能，多项流行病学研究发现，多食用十字花科蔬菜，如西兰花、甘蓝、莴苣和白萝卜等，可以降低患癌的风险[2]。主要原因是十字花科植物中富含重要的次生代谢产物硫代葡萄糖苷（简称硫苷），硫苷在内源性黑芥子酶的催化下，先水解成D-葡萄糖和一种不稳定的糖苷中间产物，进一步转化为活性物质包括异硫氰酸酯（Isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸盐、腈、亚硫腈或噁唑烷-2-硫酮等[3-5]，如图1所示。其中ITCs是一类具有R-N=C=S结构通式的化合物，是II相解毒酶的天然诱导剂，可使致癌物质分解，起到抑制癌细胞增殖的作用，是天然的抗肿瘤活性物质[6-8]。除此以外，ITCs还具有抑菌、抗炎、抗氧化等多种生物学活性，可作为天然抑菌剂、食品添加剂、杀虫剂以及抗肿瘤药物等[9-10]，具有广泛的应用价值。

目前，制备ITCs的方法主要有化学合成法和酶法，其中化学合成法步骤繁琐，合成率低，且对环境不友好[11]。酶法制备是利用十字花科植物中硫代葡萄糖苷-黑芥子酶这一系统[12-13]，从植物体中提取ITCs，具有操作简单，环保安全，产率相对较高的特点。但酶解产物的形成取决于硫苷的结构以及酶解反应条件，主要包括酶解时间、温度、压力、pH和Fe2+的存在。Latte等[14]研究发现，当反应溶液pH为中性时，有利于前体GLS水解生成异硫氰酸盐，但在环硫特性蛋白（Epithiospecifierprotein，ESP）、Fe2+存在或在酸性条件下，酶解产物会形成大量的腈类等[15]。Yuan等[16]和Wu等[17]利用十字花科植物内源黑芥子酶，采用边水解边萃取的方法，考察了酶解时间、萃取时间以及金属离子对ITCs提取的影响。采用内源酶酶解制备ITCs工艺简单，但植物中内源黑芥子酶不能完全释放，导致酶解时间长，效率低。Guo等[18]预先制备黑芥子酶，采用添加外源酶水解的方式制备ITCs，酶活性高、酶解时间短，且ITCs的产率相对较高。同时，采用响应面的方法对pH、抗坏血酸和EDTA因素进行分析，结果表明，这三种因素对异硫氰酸盐的提取率有显著影响。只有在酶解条件适宜时，酶促反应动力学才会朝着有利于生成ITCs的方向进行。因此，优化硫苷的酶解浸提条件，是成功制备ITCs的关键环节。

ITCs的分析测定方法主要有：分光光度法和色谱法，其中色谱技术又包括高效液相色谱法[19]、气相色谱法和气质联用、液质联用。气相色谱-质谱联用[20]法结合了气相色谱和质谱的优点，具有灵敏度高、分析速度快等特点，可同时完成待测组分的分离和鉴定。

本研究以西兰花种子为原料，采用外源酶解的方法，制备ITCs。在单因素实验基础上，以酶解时间、酶解温度、酶解pH为自变量，以ITCs得率为响应值，利用Design-export10软件设计响应面实验，同时采用硫脲法和GC-MS作为ITCs的定量定性检测方法，优化ITCs的酶解提取工艺，为ITCs制备和综合利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

磷酸二氢钠天津市科密欧化学试剂有限公司；碳酸氢钠天津市北辰方正化学试剂厂；乙二胺四乙酸天津市光复科技发展有限公司；抗坏血酸、二硫苏糖醇阿达玛斯试剂有限公司；石油醚、二氯甲烷上海泰坦科技股份有限公司；以上试剂均为分析纯。

BGZ-240电热鼓风干燥箱上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；BJ-400粉碎机上海拜杰实业有限公司；MYP11-2磁力搅拌器常州方科仪器有限公司；TDL-5000dR冷冻离心机上海安亭科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 黑芥子酶的制备取烘干、粉碎后的西兰花种子，过60目筛，石油醚脱脂三次，真空抽滤，得到西兰花种子粉末，至锥形瓶中备用。另取新鲜的芥菜籽，加入液氮粉碎，过60目筛，并脱脂处理，加入0.2 moL/L的磷酸缓冲液，超声振荡20 min，4000 r/min下冰浴离心30 min，并经硫酸铵分级沉淀，透析得粗黑芥子酶液，冷冻干燥，得黑芥子酶粉末。参照Li等[21]的方法，以黑芥子硫苷酸钾为底物，测得制备的粗酶液酶活为1.267 U/g。

图1 硫苷酶解过程Fig.1 Hydrolysis of glucosinolates schematic

1.2.2 ITCs提取工艺向西兰花粉末中加入用磷酸盐溶解的粗黑芥子酶，并加入0.2%的抗坏血酸，在一定温度下，酶解一定的时间，酶解结束后，加入一定量的二氯甲烷浸提液，室温浸提2 h，之后离心取下层浸提液，测ITCs提取率。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 酶量对ITCs提取率的影响以脱脂西兰花种子粉末为底物，称取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶解时间为3 h，酶解温度为30 ℃，浸提料液比为1:20 g/mL，pH为6.5的条件下，按酶与底物的质量比（1:5、1:4、1:3、1:2、1:1）混合，考察粗酶用量对ITCs提取率的影响。

1.2.3.2 酶解时间对ITCs提取率的影响以脱脂西兰花种子粉末为底物，称取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶与底物的质量比为1:3，酶解温度为30 ℃，pH为6.5，浸提料液比为1:20 g/mL的条件下，考察不同酶解时间（2、3、4、5、6 h）对ITCs提取率的影响。

1.2.3.3 酶解温度对ITCs提取率的影响以脱脂西兰花种子粉末为底物，称取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶与底物的质量比为1:3，酶解时间为3 h，pH为6.5，浸提料液比为1:20 g/mL的条件下，研究在不同酶解温度（30、35、40、45、50 ℃）对ITCs提取率的影响。

1.2.3.4 酶解pH对ITCs提取率的影响以脱脂西兰花种子粉末为底物，称取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，当酶与底物的质量比为1:3，在酶解时间为3 h，酶解温度为30 ℃，浸提料液比为1:20 g/mL的条件下，研究在不同pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）对ITCs提取率的影响。

1.2.3.5 浸提料液比对ITCs提取率的影响以脱脂西兰花种子粉末为底物，称取5等份，每份0.2 g，按照1.2.1的方法提取ITCs，在酶与底物的质量比为1:3，酶解时间为3 h，酶解温度为30 ℃，pH为6.5的提取条件下，研究了不同浸提料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）对ITCs提取率的影响。

1.2.4 响应面试验在单因素实验基础上，进行响应面实验[22]，采用Box-Behnken模型[23-24]，选取酶解时间（A）、温度（B）和pH（C）影响显著的因素为自变量，以ITCs提取率为相应值（Y），设计三因素三水平响应面实验，共17个处理组，各因素编码值见表1。

1.2.5 硫脲法测ITCs提取率参考NY1956-2008标准[25]，取0.2 g脱脂后的西兰花粉末，加40 mg粗芥子酶和2.0 mL pH 7.0缓冲溶液，旋涡混合器充分混合，35 ℃下酶促反应2 h。加2.5 mL二氯甲烷，用旋涡混合器混合均匀，在室温下振荡0.5 h，4000 r/min下离心20 min。取6 mL 80%氨乙醇于具塞试管，用微量进样器，取离心管下层有机相50 μL，加入到装有80%氨乙醇的具塞试管中，盖上塞。旋涡混合均匀，将具塞试管放入水浴锅，50 ℃下加热0.5 h，取出具塞试管，冷却至室温。用紫外分光光度计，10 mm石英比色皿测定光密度值，测定波长分别为235、245、255 nm，同时测定试样空白溶液。

表1 响应面试验因素水平设计Table 1 Factor level design of response surface test

试样中异硫氰酸酯的提取率（X）以每克干样中异硫氰酸酯的毫克数（mg/g）表示，按以下公式计算：

式中：OD235、OD245、OD255分别代表试样在245、235、255 nm处的光密度值。

1.2.6 GC-MS对酶解产物的分析将含有ITCs的酶解提取产物，用有机滤膜过滤，注入GC进样口进行分析。GC/MS使用7890A气相色谱仪结合5975C Plus质谱仪分析。色谱条件如下[23]：气相色谱柱（30 m×250 μm×0.25 μm，HP-5MS）采用氦气为运载气体，恒定流速为1.5 mL/min；进样口温度为300 ℃，进样量为10 μL，分流比20:1。色谱柱升温程序为：50 ℃保持2 min，然后以10 ℃/min升至230 ℃，保持5 min；再以30 ℃/min升至300 ℃，保持15 min；质谱条件：EI离子源温度：230 ℃；接口温度：250 ℃；四极杆温度：150 ℃；EI能量：70 eV；扫描范围m/z：50～240。

定性定量方法：样品采用GC-MS进行分析，通过MSDCHEM化学工作站对采集的数据进行处理，并根据各个化合物的分子离子峰、特征碎片离子以及色谱保留时间等与NIST11谱库数据进行匹配，最终确定酶解产物的化学成分。并使用峰面积归一化法计算硫代糖苷酶解产物中各组分的相对含量。

1.3 数据处理

实验数据表示为三次重复（n=3）的平均值±标准差（SD），使用origin8对数据进行处理和绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶量对ITCs提取率的影响酶与底物的质量比对ITCs提取率的结果如图2所示，当酶与底物的质量比为1:3时，ITCs的提取率达到最大。当底物量远大于酶的用量时，酶解反应速度与酶的用量呈正比关系，此时由于酶的用量不足，西兰花粉末中的糖苷底物不能完全得到水解，从而导致产物ITCs得率较低；增加酶的用量，底物能够得到充分的释放，但继续增加酶的用量，底物与酶的反应已达到饱和，产物的量也不再增加，而且还会增加后续浸提溶液的体积，综合考虑其最佳的酶与底物的质量比为1:3。

图2 酶与底物的质量比对ITCs提取率的影响Fig.2 Effect of the mass ratio of enzyme and substrate on the extraction rate of ITCs

2.1.2 酶解时间对ITCs提取率的影响酶解时间对ITCs提取率的结果如图3所示，ITCs的提取率随着酶解时间的延长显著增加（P＜0.05），在酶解时间为4 h时达到最高。但酶解时间超过4 h之后，ITCs提取率有所下降。酶解时间较短时，底物硫代葡萄糖苷没有得到充分酶解，产物ITCs得率较低；而在4 h之后，由于ITCs在水溶液中稳定性较差，发生加成反应而生成其他副产物。因此，随着酶解时间的延长，反而会使产物得率有所下降。综上，确定酶解最佳时间为4 h左右。

图3 酶解时间对ITCs提取率的影响Fig.3 Effect of enzymolysis time on extraction rate of ITCs

2.1.3 酶解温度对ITCs提取率的影响不同酶解温度对ITCs提取率的影响如图4所示。当酶解温度低于40 ℃时，ITCs的提取率随温度的升高而逐渐增加。当酶解温度升高到40 ℃时，酶解产物ITCs提取率最高。之后，随着酶解温度的进一步升高，酶解产物急剧减少。因此，40 ℃为黑芥子酶的最适酶解温度。黑芥子酶是较为耐热的酶，适当提高酶解温度，有利于酶活力的提高；但酶解温度过高时，也会使酶钝化，降低酶的催化效率，同时还会影响酶解产物的稳定性。

图4 酶解温度对ITCs提取率的影响Fig.4 Effect of enzymolysis temperature on extraction rate of ITCs

图5 不同pH对ITCs提取率的影响Fig.5 Effect of different pH value on extraction rate of ITCs

2.1.4 不同pH对ITCs提取率的影响不同pH对ITCs提取率的影响如图5所示，pH是影响酶解效率的主要因素之一，不同的pH条件会影响酶解产物的类型。根据杨瑛洁等[5]研究，在中性条件下其前体硫代葡萄糖苷的酶解产物主要为ITCs，在有Fe2+或pH＜5.0存在下，降解产物则以腈类为主。本实验结果也表明，酶解反应pH在4.5时，ITCs的提取率最低。而随着反应pH的增加，ITCs的提取率表现为先增后降的趋势，当pH为6.5时，ITCs的提取率最高，为最佳酶解反应pH。从本实验结果可以看出，ITCs受pH的影响较大，酶解反应中溶液pH过酸或过碱都会影响酶的活力、催化效率以及酶解反应进程，因此，选择pH5.5、6.5、7.5进行后续响应面试验。

2.1.5 浸提料液比对ITCs提取率的影响不同的提取料液比对ITCs提取率的影响，如图6所示。当浸提料液比为1:20 g/mL时，ITCs的提取率最高，当浸提料液比为1:10～1:20 g/mL的范围内时，浸提液的量不足以萃取出全部的ITCs，提取率较低；浸提料液比过高时1:30 g/mL，不仅增加了缓冲液的用量，也没有有效提高ITCs的提取得率。因此，确定最佳浸提料液比在1:20 g/mL左右。

图6 浸提料液比对ITCs提取率的影响Fig.6 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of ITCs

2.2 响应面试验优化结果分析

2.2.1 响应面试验分析从单因素实验结果可知，酶解时间、温度、pH对ITCs的提取率影响更为显著，因此选取这三个酶解因素作为响应面实验因素进行优化。根据Box-Bohnken中心组合设计原理，设计三因素三水平的响应面分析试验，17个实验组结果如表2所示。

表2 响应面试验数据Table 2 Response surface experimental data

2.2.2 二次回归方程模拟及方差分析用DesignExpert 9.0软件对表2中的实验结果进行分析后得到二阶响应表面模型方程：

对回归方程进行方差分析，结果如表3所示，显著性结果以P值表示，模型显著性检验P＜0.05，表明该模型具有统计学意义。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度，失拟项P=0.0703＞0.05，表明失拟不显著。模型决定系R2=0.9835，说明该模型拟和程度良好，实验误差小，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系。模型的校正决定系数R2adj=0.9624，说明该模型能解释约96%响应值的变化；

t检验和P值用于确定每个因素对ITCs提取率产生的影响。P值用作检查每个系数显着性的工具，数值越小，相应系数的显著性就越强。从表3中可知，二次项A2、B2、C2和交互项BC对ITCs的提取率均呈极显著性影响（P＜0.01），交互项AB、BC呈显著性影响（P＜0.05），三个因素对指标影响大小顺序为B＞A＞C。

利用上述回归方程确定最佳提取工艺条件：酶解时间3.95 h，酶解温度44.6 ℃，pH 6.52，在此条件下，进行验证试验，重复三次，ITCs提取率为8.36 mg/g，回归模型预测理论ITCs提取率为8.51 mg/g，验证值略低于预测值，其相对误差为1.80%，因此回归方程是可用的。

表3 模型的方差分析Table 3 Anova analysis for the response variables

2.2.3 各因素交互作用分析回归方程显示，各因素之间存在着一定的交互作用，图7～图9的响应面图反映了各因素在酶解过程中对响应值的影响，其投影为等高线图。响应面图坡度的陡峭程度直观地反映了各因素对响应值的影响，结果与表3中交互项的显著性一致。

图7 Y=f（A，B）的响应面Fig.7 Responsive surface plot Y=f（A，B）

图8 Y=f（A，C）的响应面Fig.8 Responsive surface plot Y=f（A，C）

图9 Y=f（B，C）的响应面Fig.9 Responsive surface plot Y=f（B，C）

2.3 酶解产物的GC-MS分析结果

通过GC-MS分析了最佳酶解条件下制备的ITCs样品。选择峰面积作为总ITCs提取相对含量的分析信号，并将MS谱图与NIST标准质谱库进行比对，谱库检索结果匹配度达95%以上的物质中，鉴定出5种酶解相关化合物，分别是4-（甲硫基）丁腈、1-异硫代氰酸丁酯、萝卜硫腈、噁唑烷硫酮、萝卜硫素，整理见表4。其中，异硫氰酸酯类主要活性物质萝卜硫素在7.42 min被检测到，其得率也最高。从图10和图11可以看出，该活性产物的质谱图与NIST谱库中萝卜硫素的谱图（图12）吻合，其特征峰72、160与谱库中萝卜硫素的匹配度达98%以上，本实验检测结果也与Gu等[15]的研究结果是一致的。

表4 GC-MS测定结果Table 4 GC-MS measurement results

图10 GC-MS总离子流图Fig.10 GC-MS total ion current diagram

图11 保留时间7.42 min的质谱图Fig.11 Mass spectrum at retention time 7.42 min

3 结论

通过单因素和响应面试验研究了各因素对ITCs提取率的影响，综合考虑各方面的因素，最终确定西兰花种子中ITCs的最佳酶解提取条件：最适pH为6.52，酶解温度为44.6 ℃，酶解时间为3.95 h，ITCs的理论提取率为8.51 mg/g，经实验验证ITCs的提取率为8.36 mg/g，其相对误差为1.8%。在此基础上，对酶解产物进行了GC-MS分析，鉴定出异硫氰酸酯类相关化合物共五种，分别为有4-（甲硫基）丁腈、1-异硫代氰酸丁酯、萝卜硫腈、噁唑烷硫酮、萝卜硫素，其中目标产物萝卜硫素的相对含量最高，表明该工艺条件用于西兰花种子中异硫氰酸酯的提取是可行的，对于进一步研究、应用、开发ITCs相关产品具有现实意义。