锡林郭勒牧区酸马奶天然发酵剂中风味物质及微生物多样性

于佳琦，夏亚男，乔晓宏，靳志敏，李鹏亮，王 茹，王 洋，双 全,

（1.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.阿巴嘎旗照富经贸有限责任公司，内蒙古锡林郭勒 011400；3.内蒙古自治区食品检验检测中心，内蒙古呼和浩特 010018；4.呼和浩特市食品检验所，内蒙古呼和浩特 010018）

锡林郭勒牧区是蒙古族文化的主要发源地之一，马匹和酸马奶是其民族文化的重要组成部分[1]。2019年锡林郭勒地区的马匹数量超过15万。母马的产奶期约73 d，属于季节性生产[2]，不同季节马奶的售价在30～40元/公斤不等。传统的酸马奶是往马奶中添加天然发酵剂后，在乳酸菌和酵母菌的作用下产酸产气的轻度酒精饮料。高品质的酸马奶均匀不分层，具有发酵的香气以及二氧化碳的刺激感[1]。发酵风味和保存在很大程度上取决于天然发酵剂中的微生物群，因此，优质的天然发酵剂是维系酸马奶产品品质的关键。为了开发工业应用的新产品并保护传统酸马奶中的微生物多样性，对酸马奶天然发酵剂的自有风味、微生物组成及功能进行详细的研究是十分有意义的。

Illumina Miseq测序是一种高通量、高精度、省时省力的第二代测序技术[3-4]，这一技术可以检测到很多非培养、低丰度的微生物[5-6]，并且弥补了传统的基于分离培养和生理生化鉴定建立系统发育树的局限，已广泛应用于对发酵食品微生态的研究。近年来，较多研究应用分子生物学技术探究酸马奶的微生物群落结构，发现不同地区以及不同的牧民制作的酸马奶细菌群落大多由乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、醋酸杆菌属、肠球菌以及部分低丰度细菌属组成[7-8]。由于传统的酸马奶天然发酵剂都是将酿成的酸马奶取出部分保留而得，因此发现其细菌群落组成与发酵酸马奶的组成相似[9]。而对酸马奶及引子中真菌多样性的探究比较少，本文是首次使用Illumina MiSeq第二代高通量测序技术专门调查酸马奶天然发酵剂中完整的微生物群落多样性并预测其中的功能信息。

本研究采用气相色谱-质谱联用（GC-MS）及Illumina Miseq第二代测序技术分析锡林郭勒牧区酸马奶天然发酵剂的主要风味物质及核心微生物群落结构，全面揭示酸马奶天然发酵剂的风味组成与微生物多样性，并结合功能预测分析风味相关功能基因，以期为工业化生产酸马奶的风味调控、品质优化和安全保障提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酸马奶天然发酵剂样本 于2019年6月采自内蒙古自治区锡林郭勒盟阿巴嘎旗的3个平行样品（命名为YZ_1，YZ_2，YZ_3），在测定总酸度和pH后分装于采样管，封口并于干冰中转移至实验室，冷冻保存用于后续试验；3-辛醇（纯度≥98%） 上海麦克林生化科技有限公司；E.Z.N.A.®soil DNA kit美国Omega Bio-tek；琼脂糖 西班牙biowest；FastPfu Polymerase 中国TransGen；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 美国Axygen。

FG2-ELK便携式pH计 Mettler Toledo；NEVAP-45氮吹仪 美国Organomation；Thermo Trace 1300-ISQ气相色谱-质谱联用仪 美国Thermo；DB-Wax（30 m×0.250 mm×0.25 μm）色谱柱 美国Agilent；日立CF16RN冷冻离心机 日本Hitachi；DYY-6C电泳仪 北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700型PCR仪 美国ABI；5424R高速台式冷冻离心机 美国Eppendorf；Miseq PE300测序仪 美国Illumina。

1.2 实验方法

1.2.1 酸马奶天然发酵剂pH及总酸度测定 在采样现场通过便携式pH计测定pH，滴定酸度参照GB 5009.237-2016《食品pH值的测定》中酚酞指示剂法测定。

1.2.2 风味物质测定方法

1.2.2.1 样品前处理 参照苏海荣[10]的方法并稍作改进，取天然发酵剂样品10 g，加入200 μL质量浓度为310 mg/L的3-辛醇内标物，加入氯化钠至过饱和（有利于香气物质的萃取）。取溶液于50 mL离心管中，4 ℃下分别用10和5 mL的乙醚以5500 r/min离心5 min萃取2次，合并上层有机相。氮吹浓缩至约0.2 mL，再以乙醚复融定容至2.0 mL，无水Na2SO4干燥，0.22 μm有机相膜过滤，供GC/MS上机分析。样品重复测定3次。

1.2.2.2 GC-MS检测条件 色谱条件：参照洪家丽等[11]方法并稍作改进，进样口温度250 ℃；进样不分流，程序升温为40 ℃保持5 min，以3 ℃/min升温至200 ℃，保持5 min，再以2 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min。载气为氦气，流速1.0 mL/min。质谱条件：离子化方式：EI；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围40～500 m/z 。

1.2.2.3 定性定量分析 利用Xcalibur工作站NIST谱库自动检索各组分质谱数据，并结合保留指数进行定性分析。采用半定量的方法计算各风味化合物的相对含量，根据内标物质（3-辛醇）与各组分峰面积比值计算[12]。

1.2.3 样品总DNA提取 使用 E.Z.N.A.®soil DNA kit试剂盒进行微生物群落总DNA抽提。提取成功后用1%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的提取质量，并使用NanoDrop2000测定DNA浓度和纯度。

1.2.4 PCR扩增及MiSeq高通量测序 细菌16S rRNA基因V3～V4可变区：上游引物：338F（5’-ACTCCT ACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物806R（5’-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。扩增程序：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在4 ℃进行保存。

真菌ITS区PCR扩增：上游引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'），下游引物：ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）。扩增程序：95 ℃预变性3 min，27个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后72 ℃稳定延伸10 min，最后在10 ℃进行保存。

PCR反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上游引物（5 μmol/L）0.8 μL，下 游 引 物（5 μmol/L）0.8 μL, TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。每个样本3个重复，将3个重复的PCR产物混合，之后使用2%琼脂糖凝胶电泳检测产物[13]。使用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit纯化PCR产物后用 Quantus™ Fluorometer进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。寄于上海美吉生物医药科技有限公司通过Illumina Miseq PE300平台进行高通量测序。

1.3 数据处理

使用Trimmomatic软件原始测序序列进行质控，使用FLASH软件进行拼接，质控过滤测序质量低、错配率高和不能进行拼接的序列，得到优质序列进行分析处理。利用上海美吉公司提供的Sanger生物云信息平台对测序数据进行细菌多样性分析及微生物功能预测。

2 结果与分析

2.1 酸马奶天然发酵剂中风味物质分析

采用液液萃取与气质联用法（LLE-GC/MS）测定鲜马奶天然发酵剂中风味化合物，总离子流图见图1。

由图1可以看出，风味化合物分离效果较好，物质种类丰富。在天然发酵剂中共检测到43种风味物质，包括18种酸类、15种酯类、6种醇类、3种芳香族化合物和1种酮，见表1。酸类物质是主要风味物质，检测到的种类及含量（891.69±2.69 μg/g）均最高，其中乙酸、L-乳酸、棕榈酸、月桂酸、癸酸和肉豆蔻酸含量均高于80 μg/g，为酸马奶天然发酵剂主要酸类物质。酸类物质的产生主要是通过乳酸菌发酵底物中的可发酵糖。酸马奶天然发酵剂中L-乳酸是含量最高的酸类物质，赋予酸马奶乳的清香以及爽口的风味[14]。乙酸具有醋酸味，口感刺激，酸而不涩。辛酸和癸酸能赋予乳制品更好的奶香品质，其含量越高，对奶香味的贡献越大[15]。可见酸类物质为天然发酵剂的刺激口感及奶香味做出了较大贡献。

酸马奶天然发酵剂中，酯类物质种类和总含量（477.04±9.45 μg/g）仅次于酸类物质。其中辛酸乙酯、9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯和E-11-十六碳烯酸乙酯含量高于40 μg/g，是主要的酯类物质。大多数酯类物质都具有水果和花香味，有研究发现酯类的形成高度依赖于酵母菌的存在，不同的酵母菌株可以提供形成不同的香气，酯含量的变化也取决于其特定的真菌微生物群落[16]。

图1 酸马奶天然发酵剂风味物质总离子流图Fig.1 Total ion current diagram of koumiss natural starter flavor substances

表1 酸马奶天然发酵剂中风味物质Table 1 Flavor substances in koumiss natural starter

醇类物质是酸马奶天然发酵剂中不可或缺的风味物质，但其风味阈值较高，因此对发酵乳的风味贡献度较小[17]。本试验中共检测到6种醇类物质，其中2,3-丁二醇、十二硫醇、异戊醇、苯乙醇和异丁醇5种醇类物质含量较高。据报道，异戊醇具有水果香和杂醇味，苯乙醇具有典型的清甜的玫瑰花香[18]，可见不同的醇类物质为酸马奶复杂的风味及口感做出了一定贡献。此外还检测到苯乙烯、1,3-二叔丁基苯、2,6-二叔丁基对甲酚3种芳香族类和3-羟基-2-丁酮。3-羟基-2-丁酮又称乙偶姻，是发酵乳产品中普遍存在的一种对风味有重要贡献的酮类物质，它能够赋予发酵乳奶香气[19]，对酸乳奶香味的增加起到决定性作用。

传统的酸马奶天然发酵剂大多是发酵后的酸马奶留存下来的一部分，乳酸菌和酵母菌发酵产生的各种酶通过一系列生化过程将原料乳分解为醇、醛、酯和氨基酸等，从而形成了独特的风味[20]，可见发酵乳的风味品质与其微生物群落密切相关，因此综合分析酸马奶天然发酵剂的风味组成及微生物多样性至关重要。

2.2 酸马奶天然发酵剂中微生物多样性分析

2.2.1 细菌和真菌序列的丰度和多样性 通过Illumina Miseq高通量测序从3个酸马奶天然发酵剂样本中共获得180069条细菌和187397条真菌高质量的优化序列，样本的平均读数分别为60023（SD=7028）和62466（SD=8359）。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平下的OTU进行划分，按最小样本序列数进行抽平，结果表明，所有样本细菌序列归属于5个门，7个纲，17个目，22个科，33个属，49个种，52个OTU。所有样本真菌序列归属于4个门，11个纲，18个目，32个科，43个属，59个种，98个OTU。

表2是关于样本信息及Alpha多样性指数表，Alpha多样性是评价微生物群落丰富性和多样性的指标。Chao1和Ace指数用来估算测序样本中所含OTU个数，反映群落丰富度[21]。本试验中样本真菌的平均Chao1指数（83.99±23.62）和Ace指数（94.51±30.44）均明显高于细菌的Chao1指数（49.89±8.56）和Ace指数（52.75±6.59）。Simpson和Shannon指数表征群落多样性，当Simpson指数值越小，Shannon值越大时，说明群落多样性越高[22]。结果显示细菌群落多样性（Simpson指数0.52±0.06；Shannon指数1.20±0.12）高于真菌群落多样性（Simpson指数0.84±0.05；Shannon指数0.50±0.13）。以上α多样性指数表明该批次酸马奶发酵剂虽然真菌物种丰富度高于细菌，但细菌的微生物群落多样性更高。

将抽平后的细菌和真菌序列作稀释性曲线，见图2，稀释性曲线趋于平缓，且随着测序量的增大，实际观测到的物种数不断减小，表明测序量的合理性，但真菌稀释性曲线中第三组样本的实际观测到的物种低于其余两组，说明该组样本的重复性略差，可能与样品本身以及测序环境有关。细菌和真菌的Shannon-Wiener曲线趋于平坦，测序趋于饱和，结合表中样本的Coverage值均大于99.9%，表明该测序结果能充分解释鲜马奶发酵剂样品的微生物群落信息，仅有很少一部分的微生物群落未被覆盖到。

2.2.2 细菌群落组成多形性分析 将每个OTU代表序列与Silva数据库进行比对，结果见图3，所有细菌序列归属于5个细菌门，包括厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和Patescibacteria。天然发酵剂的优势细菌门为厚壁菌门，平均相对丰度87.78%，其次为变形菌门，平均相对丰度12.00%，两个细菌门总计占整个酸马奶引子样本的99.78%，而其余未提及到的细菌门相对丰度较低，均在1%以下。在属水平上共鉴定出了33个细菌属。平均相对丰度大于1%的属共有五个，包括乳杆菌属（Lactobacillus）、乳球菌属（Lactococcus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、劳特菌属（Raoultella）和链球菌属（Streptococcus），总计占细菌群落的97.41%。酸马奶天然发酵剂的群落组成中，乳杆菌属为优势菌属，相对丰度最高（72.26%），其次为乳球菌属（11.92%），这与前人的研究结果一致[23]。

乳酸杆菌、乳球菌以及链球菌被定义为天然发酵乳中的核心微生物群，它们的代谢终产物和酶对发酵乳的质地风味有重要的影响[24]，并可以通过产生有机酸和抗生素等物质抑制腐败菌和病原微生物的生长[25]。赵飞燕等[26]研究发现鲜马奶中存在肠球菌属、肠杆菌属以及芽孢杆菌和气单胞菌等有害微生物，可能会导致产品的质地，颜色和风味变差，也可能对消费者的健康状况有所影响，产生严重的疾病。本实验在采样时测得酸马奶天然发酵剂pH为3.69±0.03，滴定酸度为169.90±17.36 °T。天然发酵剂的低pH环境、乳酸菌的竞争性保护作用和特有微生物产生的抑菌物质等可以抑制有害微生物生长，提升产品的品质。

传统乳制品酸马奶在世界各地已有长时间的消费历史，经过长期的自然选择作用，优质的乳酸菌菌种已经流传下来[27]。生产酸马奶所添加的天然发酵剂，更是获得优质乳酸菌的良好来源。

表2 样本细菌和真菌信息及Alpha多样性指数Table 2 Sample bacterial and fungal information and Alpha diversity index

图2 样本的稀释性曲线和Shannon-Wiener曲线Fig.2 Sample dilution curve and Shannon-Wiener curve

图3 酸马奶天然发酵剂基于门水平（a）和属水平（b）细菌相对丰度柱状图Fig.3 Histogram of relative abundance of bacteria in koumiss natural starter based on phylum level (a) and genus level (b)

2.2.3 真菌群落组成多样性分析 真菌也是酸马奶天然发酵剂中非常重要的一类微生物区系。通过ITS序列，结果见图4，绝对的优势真菌被鉴定为子囊菌门（Ascomycota），相对丰度为99.32%。3个样本共鉴定出43个真菌属，数量明显高于细菌属，然而样本平均相对丰度大于1 %的属有2个，包括德克酵母属（Dekkera）和克鲁维酵母属（Kluyveromyces），表明酸马奶天然发酵剂中有很多低丰度存在的真菌微生物。德克酵母属为优势真菌属，相对丰度占94.09%。

酵母菌对酸马奶的风味、质地和营养价值有着重要的促进作用。酵母菌产生的酶分解形成脂肪酸，并进一步发生酯化反应得到具有芳香味的酯类[28]，可以与乳酸菌共同分解蛋白质产生大量的氨基酸[29]等。据调查，克鲁维酵母、哈萨克斯坦酵母、假丝酵母属等是酸马奶中经常被分离得到的酵母菌[30-32]。本试验中天然发酵剂的优势酵母菌种类与其他学者研究存在一定差异，分析原因可能与特定地区的气候、草场等环境因素，和不同牧民传统的制作方法以及所接种的发酵剂差异有关。而实际上，德克酵母属在酸马奶的真菌组成中也较常见，一些学者在新疆、青海、内蒙古、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦等地的酸马奶中分离得到了德克酵母属[33-35]，只是没有作为优势酵母菌被发现。研究发现德克酵母可以产生醋酸气味[36]，酿酒酵母、德克酵母与克鲁维酵母等在乳制品发酵过程中对水解蛋白质和脂肪、乳酸代谢、产生酒精和特殊风味有突出贡献[37-38]。如此看来，天然发酵剂中德克酵母和克鲁维酵母的存在可以为发酵酸马奶形成典型风味起到积极促进作用。

图4 酸马奶天然发酵剂基于门水平（a）和属水平（b）真菌相对丰度柱状图Fig.4 Histogram of relative abundance of fungal in koumiss natural starter based on phylum level (a) and genus level (b)

2.3 功能预测分析

采用PICRUSt软件对天然发酵剂中的细菌群落微生物进行功能预测。结果见表3，通过与KEGG数据库（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）对比，共注释到6类一级代谢通路，代谢作用（Metabolism）、遗传信息处理（Genetic Information Processing）和环境信息处理（Environmental Information Processing）是主要代谢通路，平均占比分别为67.97%、14.04%和8.36%。在二级代谢通路中共注释到42个子功能组成，其中属于上述3类一级通路且相对丰度＞0.1%的子功能见表3。参与新陈代谢的菌群主要富集在碳水化合物代谢（Carbohydrate metabolism，16.24 %）、氨基酸代谢（Amino acid metabolism，8.20%）等。遗传代谢类通路中主要富集在翻译（Translation，5.94%）、复制和修复（Replication and repair，5.44%）以及折叠分类和降解（Folding, sorting and degradation，2.30%）。环境信息处理类通路中膜转运（Membrane transport）和信号传导（Signal transduction）为主要的子功能。在酸马奶天然发酵剂中，碳水化合物代谢及氨基酸代谢作用最为突出。具体地，碳水化合物代谢主要包括三羧酸循环、糖酵解和磷酸戊糖途径等，可产生大量的乙酸、柠檬酸等风味中间代谢产物[39]。氨基酸可以在酶的作用下产生风味成分[40]，由此推测天然发酵剂中的主要风味物质来源于碳水化合物代谢和氨基酸代谢途径。除此之外还有很多的有益功能信息，如核苷酸代谢（Nucleotide metabolism）、辅助因子和维生素代谢（Metabolism of cofactors and vitamins）、聚糖生物合成和代谢（Glycan biosynthesis and metabolism）、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢（Metabolism of terpenoids and polyketides）等。

表3 KEGG数据库主要代谢通路丰度值Table 3 Abundance of main metabolic pathways in KEGG database

经KEGG数据库分析发现在酸马奶天然发酵剂细菌群落中预测到1623种酶，真菌群落中预测到847种，细菌群落和真菌群落中共有568种酶相同，表4是细菌真菌中丰度平均值排前50的酶类。从表4中可以看出，除与细菌、真菌生长相关的酶外，与代谢相关的酶中参与碳水化合物代谢和氨基酸代谢的酶广泛存在。三羧酸循环中关键酶琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase）、苹果酸脱氢酶（Malate dehydrogenase）、丙酮酸脱羧酶（Pyruvate decarboxylase）等均有发现，β-半乳糖苷酶（Betagalactosidase）和α-半乳糖苷酶（Alpha-galactosidase）属于乳杆菌目的酶，可催化生成低聚半乳糖及半乳糖寡糖，有益于人体的健康[40]。同时，乙醇脱氢酶（Alcohol dehydrogenase）、醛脱氢酶（Aldehyde dehydrogenase）、蛋白酪氨酸磷酸酯酶（Protein-tyrosinephosphatase）、组氨酸激酶（Histidine kinase）等氨基酸代谢相关酶均存在，表明酸马奶发酵剂中风味物质的很可能主要来源于糖代谢及氨基酸代谢，而乙酰辅酶A羧化酶（Acetyl-CoA carboxylase）、甘油激酶（Glycerol kinase）、醋酸激酶（Acetate kinase）等脂肪酶的存在说明还有一部分风味物质可能源自脂类代谢。

3 结论

本研究对锡林郭勒牧区酸马奶天然发酵剂中的风味物质和微生物多样性进行了测定和分析。天然发酵剂中共检测到43种风味物质，其中L-乳酸、棕榈酸、月桂酸、乙酸、癸酸和肉豆蔻酸是主要酸类物质，辛酸乙酯、9,12,15-十八碳三烯酸乙酯、乳酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯和E-11-十六碳烯酸乙酯是主要的酯类物质，2,3-丁二醇、十二硫醇、异戊醇、苯乙醇和异丁醇5种醇相对含量较高，还有少量芳香族类和酮类化合物。微生物多样性分析表明，细菌群落主要包括乳杆菌属、醋酸菌属、乳球菌属和链球菌属等，其中乳杆菌属为优势细菌属，相对丰度为72.26%。真菌群落主要包括德克酵母属和克鲁维酵母属，其中德克酵母为优势真菌属，相对丰度94.09%。酸马奶天然发酵剂中真菌的丰富度更高，然而细菌微生物更多样，表明多数的真菌微生物以低丰度存在。经基因功能预测，发酵剂碳水化合物代谢及氨基酸代谢功能突出，且存在大量代谢通路中的酶基因，为酸马奶发酵过程风味物质的形成奠定了遗传基础。