马奶营养品质及功能特性的发酵动态分析

张萌萌,赵雪妮,双全,张凤梅

(内蒙古农业大学 食品科学与工程学院,内蒙古 呼和浩特,010000)

马是五畜之首,对蒙古族的生产、生活有重要影响。马业发展历史悠久,是内蒙古地区的特色产业,尤其是锡林郭勒盟的阿巴嘎黑马和乌珠穆沁马品种优良,以体大悍威、产奶量高和体型优美、耐力较好等特性而闻名,其鲜马奶、酸马奶等系列乳产品也逐年迅速发展,深受少数民族地区居民的喜爱。马奶的乳脂肪细腻,酪蛋白含量与乳清蛋白的比例与母乳接近,更易被人体吸收和利用[1]。马奶能保护马驹免受结核菌感染,拮抗致病微生物,克服抗生素应用带来的医源性菌群失调症。鲜马奶经微生物发酵可对马奶的香气、质地和酸度等产生影响,使其具有更高的营养价值[2]。酸马奶作为一种药食同源的食品,具有一定的医疗保健价值[3],可以调节肠道菌群平衡,进而调控血脂趋于正常水平,缓解高脂血症[4]。

近年已有对马奶的基本营养成分进行检测的研究,但关于马奶发酵过程中理化指标与功能特性的变化过程研究甚少。因此,本研究以具有地区代表性的阿巴嘎黑马和乌珠穆沁白马鲜马奶为原料,通过自然发酵的方法,分析2种鲜马奶发酵过程及其发酵前后的营养价值和功能性指标的变化,为开发、利用内蒙古丰富的马奶资源提供实验基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

DPPH、ABTS上海源叶生物科技有限公司;铁氰化钾,天津福晨化学试剂有限公司;FeCl3,天津市双船化学试剂厂;乙酸乙酯,天津新技术产业园区科贸化学试剂有限公司;邻苯二甲醛,成都艾科达化学试剂有限公司;胆固醇,日本半井化学药品株式会社。H2SO4、CuSO4、K2SO4、异戊醇、盐酸、甲醇、正庚烷等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

KDY-9860凯氏定氮仪,上海海能仪器有限公司;FG2便携式pH计,上海梅特勒-托利多仪器有限公司;LZKJ脂肪离心机,黑龙江龙泽科技发展有限公司;LA8080高速氨基酸分析仪,日立株式会社日立高新技术科学那珂事业所;U-5100紫外分光光度计,日本东京日立高科技公司;CR-20色差仪,日本柯尼卡美能达。

1.3 实验方法

1.3.1 马乳的发酵工艺流程

将新挤出的鲜马奶倒入无菌无霉的器皿中,然后加入12.5%酸马奶引子,立即进行搅拌混匀,在26 ℃下自然发酵并定时搅拌,发酵过程中的马奶分别在pH为6.0、5.0、4.5、4.0及3.8时进行取样,并检测分析其营养成分、功能特性。

1.3.2 马奶主要营养成分的测定

量取10 mL鲜马奶及发酵过程中的乳样置于50 mL锥形瓶中,用pH计测得其pH值。

参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定-凯氏定氮法》对蛋白质含量进行检测。称取10 mL乳样,加入0.4 g CuSO4、6 g K2SO4及20 mL H2SO4于消化炉进行消化,取出冷却后加入50 mL水于凯氏定氮仪测量。

参照GB 5009.6—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定-盖勃法》对脂肪的含量进行测定。于盖勃氏乳脂计中先加入10 mL H2SO4,再加入10.75 mL乳样和1 mL异戊醇,置65 ℃水浴中5 min,取出后置于离心机中以1 100 r/min的转速离心5 min,水浴5 min,取出读数。

参照GB 5413.5—2010《食品安全国家标准 婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定 莱因-埃农氏法》对乳糖含量进行测定,乳糖为乳制品中的主要碳水化合物。称取预先在烘箱中干燥2 h的乳糖标样约0.75 g,定容至250 mL后滴定。然后取10 mL费林氏液,再加入20 mL蒸馏水,维持沸腾状态2 min,滴入3滴次甲基蓝溶液,溶液蓝色完全褪尽即为终点,根据样液消耗的体积计算乳糖含量。

参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定-直接干燥法》对水分含量进行测定。于称量瓶内加10 mL乳样,105 ℃干燥1 h左右,冷却0.5 h后再称量,并重复以上操作至前后2次质量差不超过2 mg为恒重。

参照GB 5009.4—2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》对灰分含量进行测定。称取10 mL乳样后,加入1 mL乙酸镁溶液,在(550±25)℃灼烧4 h,放入干燥器中冷却30 min。重复灼烧至前后2次称量相差不超过0.5 mg为恒重。

吸取0.5 mL乳样滴于数字折光仪棱镜上对可溶性固形物含量进行测定;食物营养能量按公式(1)计算：

能量/[kJ·(100 mL)-1]=17×蛋白质含量+37×脂肪含量+17×碳水化合物含量

(1)

参照GB 5009.124—2016《食品安全国家标准 食品中氨基酸的测定》进行氨基酸组成及含量测定。取10 mL乳样,加入10 mL的盐酸混匀后,继续向水解管内加入苯酚4滴,重复抽真空、充入N23次后,水解22 h。加入1 mL的pH 2.2柠檬酸钠缓冲溶液到干燥后试管内溶解,通过0.22 μm滤膜后转移至氨基酸自动分析仪测定。

参照GB 5009.168—2016《食品安全国家标准 食品中脂肪酸的测定》进行脂肪酸种类及含量测定。称取10 mL乳样,加入约100 mg焦性没食子酸,再加入2 mL的95%乙醇和4 mL的水,混匀后加入氨水5 mL于80 ℃水浴中水解20 min,再加入10 mL 95%乙醇,于旋转蒸发仪浓缩至干,残留物为脂肪提取物。向脂肪提取物中加入2% NaOH 8 mL质量浓度为20 g/L NaOH-甲醇溶液,水浴回流直至油滴消失。从回流冷凝器上端加入7 mL的15%三氟化硼甲醇溶液、10 mL正庚烷和饱和NaCl水溶液,静置分层。吸取5 mL上层溶液,加入3 g无水Na2SO4,静置5 min,吸取上层溶液并测定。

1.3.3 马奶功能特性的测定

将发酵过程中的马奶样品振荡混匀,用1 mol/L的NaOH溶液、1 mol/L的HCl溶液调节样品pH为4.6(酪蛋白等电点),经6 000 r/min离心15 min,取上清液备用。

参照王卉[5]的方法测定发酵过程中的马奶样品对DPPH自由基清除能力并加以优化。以无水乙醇作为对照组,取1.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH-乙醇溶液与1.5 mL的乳样在试管中,加入蒸馏水3 mL,混匀后测定其吸光值。

参照王琪[6]的方法测定·OH清除能力并加以优化。以蒸馏水作为对照组,吸取1 mL的样品,与9 mmol/L的FeSO4溶液、9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液、8.8 mmol/L的H2O2溶液,振荡混匀,8 000 r/min离心10 min,取上清液测定吸光值。

参照NIE等[7]的方法测定ABTS阳离子自由基清除能力。用0.05 mol/L的PBS(pH 5.5)稀释ABTS工作液,取4 mL ABTS工作液与200 μL样品于试管中,混匀后静置6 min,于734 nm处测其吸光值。

参考王卉[5]的方法采用铁氰化钾法测定还原活性。取1 mL样品加入2 mL的0.2 mol/L 磷酸盐缓冲溶液(pH 6.6)以及质量浓度10 g/L的铁氰化钾溶液,50 ℃水浴反应20 min。再加入2 mL质量浓度100 g/L 三氯乙酸,摇匀,6 000 r/min离心20 min,取上清液2.0 mL,加入去离子水2.0 mL和0.4 mL的质量浓度1 g/L 三氯化铁,50 ℃水浴反应10 min,于700 nm处测定吸光值。

参照MONTGOMERY等[8]的方法测定降胆固醇能力。分别吸取1 mL乳样和5 mL无水乙醇,混匀,经3 000 r/min离心20 min,取上清液0.5 mL,加入1 mL浓硫酸、2 mL的1 g/L邻苯二甲醛,以蒸馏水替代样品为对照组,漩涡振荡摇匀,静置显色10 min,于波长550 nm处测吸光值。

参照宝冠媛[9]的方法,采用牛津杯法对发酵过程中的马奶样品进行抑菌实验。选择大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌和鼠伤寒沙门氏菌作为指示菌,用无菌生理盐水配制106CFU/mL的指示菌悬液。首先在灭菌平板中倒入15 mL营养琼脂培养基后放入已灭菌的牛津杯(直径为8 mm),倒入15 mL含有150 μL指示菌悬液的半固体营养琼脂培养基,吸取150 μL样品加入孔内,室温扩散3 h后,置于37 ℃培养箱中培养。

1.4 数据处理分析

采用SPSS 26.0对数据进行统计学分析,以平均数±标准偏差的形式表示(n=3),组间均值比较使用单因素方差分析(One-way ANOVA)的Duncan’s 功能进行显著性分析(P<0.05),采用Excel 2019和Origin 2021作图。

2 结果与分析

2.1 两种马奶发酵过程中pH值的变化

如图1所示,白马鲜马奶和黑马鲜马奶的初始pH分别为6.90和6.98,加入酸马奶引子后马奶的pH值迅速降至6.05和5.83,马奶发酵16 h后pH下降至4.44和4.41,发酵24 h后pH下降至4.0左右,到32 h时pH降至4.0以下,二者发酵终点pH均在3.8～3.9。pH下降可能是由于乳酸菌在发酵过程中代谢生成乳酸、有机酸等酸性物质。

2.2 两种鲜马奶常规营养特性及其发酵过程中的变化

2.2.1 马奶主要营养成分的变化

马奶不同pH下的营养成分如表1所示,黑马鲜马奶的蛋白质含量、脂肪含量显著高于白马鲜马奶,白马鲜马奶的乳糖含量、可溶性固形物含量高于黑马鲜马奶,二者水分、灰分含量之间的差异不显著。在马奶发酵过程中蛋白质被水解成多肽、氨基酸等小分子物质作为乳酸菌的“氮营养源”,理论上有所减少,但是消耗量甚小,因此从宏观看,蛋白质含量变化不显著。马奶发酵过程中脂肪稍有变化,可能是微生物将脂肪分解为小分子的脂肪酸,且脂肪酸与醇类物质发生酯化反应,造成脂肪含量下降。发酵过程所测得的脂肪平均含量高于孙天松[10]所研究的新疆地区酸马奶的脂肪含量,说明不同地区马乳的基本营养成分存在差异。

表1 马奶不同pH下的营养成分Table 1 Conventional nutrients of different varieties of fresh and koumiss

结果表明,黑马马奶中蛋白质、脂肪、水分、灰分含量在发酵过程中各时间点的差异均不显著(P>0.05)。2种马奶发酵后乳糖含量均呈下降趋势,且各时间点的乳糖含量差异显著(P<0.05)。在马奶发酵过程中乳糖被微生物分解为半乳糖和葡萄糖,适宜乳糖不耐受人群的饮用且单糖更易于人体吸收。2种马奶发酵过程中各时间点的可溶性固形物含量具有显著差异(P<0.05),可溶性固形物含量的下降趋势与乳糖含量的下降趋势较为接近,白马、黑马鲜马奶能量也随之呈下降趋势。

2.2.2 马奶氨基酸的组成和含量

酸马奶是优质的氨基酸食物来源,氨基酸含量在发酵过程中受乳酸菌降解蛋白质的影响而发生变化。不同种类氨基酸能协调影响发酵乳的营养、功能等[11],参与体内主要代谢途径的调控。鲜马奶和酸马奶的氨基酸组成及含量如表2所示,本研究中酸马奶的氨基酸总量(total amino acid,TAA)和必需氨基酸(essential amino acid,EAA)含量均高于鲜马奶,黑马马奶在发酵前后的氨基酸总量和必需氨基酸含量均高于白马马奶。

2种鲜马奶的必需氨基酸中,均是亮氨酸含量最高,亮氨酸可与异亮氨酸和缬氨酸协同修复肌肉,控制血糖,为身体组织提供能量[12]。而在2种酸马奶的总氨基酸组成中谷氨酸含量最高,分别为0.32和0.45 g/100 g。谷氨酸可为肠上皮细胞提供能源物质,增强肠道抗氧化能力[13]。必需氨基酸中亮氨酸含量最高。在发酵结束后,黑马酸马奶的氨基酸含量高于白马酸马奶,且检测出的氨基酸含量在2种马奶中均有所提高。必需氨基酸和总氨基酸含量均有提高。

表2 鲜马奶和酸马奶的氨基酸组成及含量 单位g/100 g

2.2.3 马奶脂肪酸的组成和含量

2种鲜马奶和酸马奶的脂肪酸组成及含量如表3所示,2种发酵前后马奶中棕榈酸、亚麻酸含量较高,亚麻酸是维持机体功能不可缺少的必需脂肪酸,具有调节血脂、护肝等功效[14]。与黑马鲜马奶相比,白马鲜马奶中棕榈酸和亚麻酸的含量较高,亚油酸含量较低,与李枝[15]研究一致。黑马鲜马奶的月桂酸含量也高于白马,月桂酸具有抗菌特性[16]。白马鲜马奶的不饱和脂肪酸含量较黑马更高,为50.55%,故白马鲜马奶的脂肪酸营养价值高于黑马鲜马奶。

表3 鲜马奶和酸马奶的脂肪酸组成及含量 单位：%

发酵结束后,白马酸马奶的饱和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)含量较鲜马奶有所提高,而不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)、多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)含量降低。黑马酸马奶与鲜马奶相比饱和脂肪酸含量降低,不饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸含量均提高。黑马酸马奶的油酸相对比例高于鲜马奶,曹永强等[16]研究发现油酸在调节血脂、降胆固醇中起重要作用。SFA∶MUFA∶PUFA是评价脂肪酸营养价值的重要指标,黑马酸马奶的比例为36.78∶32.50∶30.73,与世界卫生组织推荐的比例1∶1∶1较为接近[17],故认为黑马酸马奶的脂肪酸组成及相对含量更接近推荐比例。

2.3 马奶功能特性的变化

2.3.1 马奶发酵过程中抗氧化活性的变化

如图2所示,2种马奶发酵后对3种自由基的清除能力均增强,在发酵过程中呈上升趋势(P<0.05)并略有起伏变化。黑马马奶发酵后的DPPH自由基、ABTS阳离子自由基清除能力高于白马马奶,白马马奶发酵后的·OH清除能力高于黑马马奶。随着pH逐渐降低,可能是由于乳酸菌在生长过程中可清除部分自由基基团[18]。两种酸马奶经发酵完成后的还原力较发酵前的鲜马奶均为显著增强(P<0.05)。白马和黑马酸马奶的还原力分别为(0.256±0.01)和(0.309±0.02)，黑马马奶在发酵过程中的还原力较同时期的白马马奶更强。

综上,2种马奶经发酵作用后抗氧化活性显著增强(P<0.05),其中黑马马奶对DPPH自由基、ABTS阳离子自由基的清除能力及还原力较强,白马马奶对·OH的清除能力较强。因此,与白马酸马奶相比,黑马酸马奶的抗氧化活性较强。

a-ABTS阳离子自由基清除率;b-DPPH自由基清除率;c-·OH清除率;d-还原力图2 马奶发酵过程中自由基清除能力的变化Fig.2 Changes of free radical scavenging ability during mare milk fermentation

2.3.2 马奶发酵过程中胆固醇活性的变化

测定不同胆固醇的质量与OD550值之间的对应关系见公式(2)：

y=1.002 3x+0.004 3

(2)

其相关系数R2为0.995 8,2种马奶发酵至酸马奶后胆固醇降解率均显著上升(P<0.05)。如图3所示,黑马马奶发酵后的胆固醇降解率显著增加,增加了8.45%,其降解率为(13.60±0.01)%。白马马奶发酵后胆固醇降解率增加了4.36%,提升至(10.95±0.20)%。这可能是由于发酵后马奶的不饱和脂肪酸、乳清酸和乳酸菌等益生物质的增加[19],乳清酸能够抑制胆固醇的生成,可以降低血液中总胆固醇含量,防止动脉粥样硬化;不饱和脂肪酸可促进胆固醇酯生成并使其转化为高密度脂蛋白[20]。而黑马酸马奶的不饱和脂肪酸含量较高,因此其胆固醇降解率相对较高。

图3 马奶发酵过程中降胆固醇能力的变化Fig.3 Changes of cholesterol removal ability during mare’s milk fermentation

2.3.3 马奶发酵过程中抑菌能力的变化

表4所示,2种马奶发酵后对3株指示菌的抑制能力均有不同程度的显著提升(P<0.05)。黑马酸马奶在发酵完成时,大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌上的抑菌圈直径分别为(15.29±0.95)、(16.60±1.06)、(15.86±0.25)mm,白马酸马奶在3株指示菌上的抑菌圈直径分别为(14.80±0.33)、(15.63±0.42)、(15.43±0.62) mm。结果表明,黑马酸马奶、白马酸马奶对3株指示菌有抑制效果,且随着pH下降,抑菌圈直径逐渐增大,抑菌效果逐渐增强。食品中的抑菌成分主要为有机酸[21]、短肽[22]、乳酸菌等[23],发酵可使马奶中的乳酸菌竞争抑制病原菌的生长,代谢生成有机酸和乳酸,有机酸和乳酸也可抑制病原菌的生长,故发酵后的马奶对3株指示菌的抑制能力随pH降低而增强。

表4 马奶发酵过程中抑制致病菌能力的变化Table 4 Changes of inhibitory ability of during mare milk fermentation

3 结论

阿巴嘎黑马与乌珠穆沁白马的鲜马奶的主要营养成分、抗氧化特性和胆固醇脱除力具有显著差异。在发酵过程中,2个品种酸马奶的营养品质、功能特性的变化趋势一致并呈上升趋势。发酵降低了乳糖含量,适于乳糖不耐受人群饮用;发酵还提高了氨基酸和脂肪酸等微量元素的含量,提升了马乳的抗氧化活性、抑菌特性和胆固醇脱除力,证明酸马奶可以用于辅助增强免疫力、促进胃肠道消化、预防高胆固醇血症和动脉硬化等。因此,本研究为更好地开发、利用内蒙古丰富的马奶资源提供了新的方向与应用前景,为后续工业化生产和下一步研究提供了实验基础和理论依据。