鸡肉生产中分离金黄色葡萄球菌的基因分型与耐药性分析

李佳婷，柳雅馨，宋 琪，王艺华，沈奕漩，冯旭凯，刘 斌

（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌 712100）

食源性致病菌引起的食源性疾病是全球范围内最重要的食品安全问题之一，而金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）则是在其中排列前位的致病菌，也是临床上人类化脓感染中最常见的病原菌之一[1]。金黄色葡萄球菌拥有多种毒力基因，会分泌超抗原外毒素（pyrogenic toxin superantigens，SAgs）、溶细胞素和其他外切酶等毒力因子。超抗原外毒素是一类分泌型毒力因子，包括中毒性休克综合征毒素-1（toxic shock syndrome toxin 1，TSST-1）、葡萄球菌肠毒素（staphylococcal enterotoxins，SEs）和类肠毒素蛋白（staphylococcal enterotoxin-like toxins，SEls），其中危害最大的是葡萄球菌肠毒素[2-4]。金黄色葡萄球菌引起食物中毒通常是因摄入含有肠毒素污染的食物引起的，金黄色葡萄球菌经80 ℃、30 min的加热可以将其彻底杀死，肠毒素具有耐热性，一般的烹调温度难以将其破坏，这使其能够顺利进入到体内而不丧失活性，且肠毒素对胃蛋白酶、胰蛋白酶以及低酸度的环境均具有抗性，摄入后会在消化道中产生毒性作用，当人进食了含有由金黄色葡萄球菌产生的肠毒素污染的食物，就可引起食物中毒，会有呕吐、恶心、腹泻、腹痛等相关症状[5-6]。迄今为止，已经鉴定出24种肠毒素，其中包含18种可产生催吐作用的肠毒素（SEA、SEB、SEC、SED、SEE、SEG、SEH、SEI、SEK、SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER、SES、SET）和5种尚待证实可产生催吐作用的SEls（SElJ、SElU2、SElV、SElX、SElY）[7]。编码不同的肠毒素是由不同的流动遗传元件如噬菌体、质粒、致病岛（Staphylococcus aureuspathogenicity island，SaPI）、肠毒素基因簇（enterotoxingene cluster，EGC）和葡萄球菌盒式染色体（staphylococcal cassettechromosome，SCC）等携带和传播的。由携带经典肠毒素基因（sea、seb、sec、sed、see）的金黄色葡萄球菌引起的食物中毒比例高达95%[8]。同时也有文献表明，近年来越来越多不同类别食物中有新型肠毒素基因seg、seh、sei、sej检出[9]。

金黄色葡萄球菌污染的食物主要以富含蛋白质食物为主，如火腿、生鲜肉、加工后的红肉、金枪鱼、三明治馅料、蛋、乳及其制品以及奶油烘焙产品等[10]。而鸡肉制品因肉嫩味鲜、蛋白质丰富、热量低，深受人们的喜爱，但在加工制作环节中极易受食源性病原菌的污染。2017～2018年，在对成都市部分学校食堂、养殖场及屠宰场采集的鸡肉样本检测时发现，加工环节中的生肉类产品污染最严重，金黄色葡萄球菌检出率高达54.2%[3]。国内外研究也证实，在不同时期、区域、生产环节采集样品后，发现鸡肉产品中金黄色葡萄球菌的污染率在亚洲国家所有食品中是最高的[11]，鸡肉切分车间中的不同传送带（腿、翅、架）、刀具、案板的黄色葡萄球菌数量分别可达到4.10、3.64、3.87、2.65、3.461（CFU/cm2）[12]，若食用了携带金黄色葡萄球菌的鸡肉制品，将会带来极大的安全隐患。

抗生素可以抑制细菌的生长，在临床治疗得到了很广泛的应用。但是，抗生素的滥用导致多重耐药菌株（multi-drug resistamt bacteria，MDR）出现[13]。特别是近年来出现的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistantstaphylococcusaureus，MRSA）菌株，因携带编码新特异性青霉素结合蛋白（PBP2a）的mecA基因，几乎对所有的β-内酰胺类抗生素都表现出抗性[14]。因此，金黄色葡萄球菌成为国内外研究者关注的重要致病性菌株，并通过脉冲场凝胶电泳法（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位点序列分型法（multilocus sequence typing，MLST）和金黄色葡萄球菌蛋白A分型法（staphylococal protein A，SPA）等分子分型方法对该菌株进行流行病学研究。其中MLST是在多位点酶切电泳技术的基础上发展起来的一种基因分型方法，重复性好，简便易行，建有大型数据库国际网站，便于在全球监测和调查金黄色葡萄球菌传播与溯源[15]。

目前，我国关于鸡肉制品企业生产链上金黄色葡萄球菌污染情况的研究相对很少，由该菌引起的食品安全事件的菌源追溯及菌源控制也就缺乏相应的依据。鸡肉制品生产过程，一般先经过屠宰车间，然后进入切分车间进行净膛、二级清洗预冷消毒、切分腿、翅、胸、皮，然后心、肝、头、脖、爪、鸡架等副产品进入副产品车间。进入屠宰车间的鸡本身携带大量病原菌，同时切分车间的生产工人、工具、设备、空气、预冷水及生产用水之间的交叉污染也会增加鸡肉制品的污染水平。有研究证实，切分车间是金黄色葡萄球菌污染鸡肉制品的主要途径之一[16]。本研究以陕西省某地区鸡肉制品加工厂为采样点，对肉表面和鸡肉加工过程所处环境进行采样，通过对金黄色葡萄球菌检测阳性样本进行肠毒素基因检测、MLST分型及耐药性分析，确定金黄色葡萄球菌污染的关键环节及菌株特征，从而为有效防止鸡肉加工过程中金黄色葡萄球菌污染和我国鸡肉加工企业在加工过程中的安全控制与菌源追踪提供科学依据及理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

金黄色葡萄球菌的标准菌株（ATCC6538、ATCC25923） 西北农林科技大学食品科学与工程学院健康食品制造与安全实验室提供；细菌DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；聚合酶链式反 应（polymerase chain reaction，PCR）用 Taq DNA聚 合 酶、10×PCR buffer、dNTPs、Mg2＋、DL2000 DNA Marker和引物 北京康为生物有限公司；氯霉素、青霉素G、环丙沙星、克林霉素、磺胺甲恶唑、四环素、庆大霉素、万古霉素、利福平 北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂 均为分析纯，国药集团上海化学试剂有限公司。

CFX96 PCR基因扩增仪 美国Bio-rad公司；GelDoc XR凝胶成像系统 美国Bio-rad公司；Cary 60紫外分光光度计 美国安捷伦公司；BSC-1000生物安全柜 苏州净化设备有限公司；DW-86L490超低温冰箱 海尔公司；ULUP超纯水机 四川优普超纯科技术有限公司；5418R台式离心机 德国Eppendorf公司。

1.2 实验方法

1.2.1 金黄色葡萄球菌菌株的分离与鉴定 准备若干灭菌棉拭子，从陕西省某地区鸡肉制品加工厂采集样品，采集部位包括加工环节的肉表面（烫洗煺毛、清洗预冷、净膛、分割、成品）和环境部位（烫毛机、刀具、内脏、预冷池水、传送带、操作工人手部），共计260份，根据《食品安全国家标准-食品微生物学检验-金黄色葡萄球菌检验》（GB4789.10-2016）的发布方法对样品进行预处理、增菌、分离、初步及确证鉴定。

1.2.2 基因组DNA的提取 根据细菌DNA提取试剂盒的操作说明书，提取金黄色葡萄球菌基因组DNA，将提取好的DNA保存于-20 ℃冰箱，待后续试验使用。

1.2.3 PCR检测肠毒素基因 选择sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej9种肠毒素基因进行PCR检测。根据相关文献和检索[4-5,10]，得到金黄色葡萄球菌肠毒素基因引物序列（表1）。PCR反应体系共20 μL，其中：ddH2O 7.4 μL、2×Taq PCR Master Mix 10 μL、上游引物和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，DNA提取物1 μL。PCR程序运行参数：95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min，共进行35次循环；72 ℃，10 min。PCR反应片段长度与退火温度如表1所示，在PCR基因扩增仪中进行，反应结束后冷却至4 ℃。用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察结果，并在凝胶成像系统中捕获图像。

1.2.4 多位点序列（MLST）分型 金黄色葡萄球菌的7个管家基因分别是arcC（编码氨基甲酸酯激酶，456 bp）、aroE（编码苯草酸脱氢酶，456 bp）、glpF（编码甘油激酶，465 bp）、gmk（编码鸟苷酸激酶，429 bp）、pta（编码磷酸转乙酰酶，474 bp）、tpi（编码磷酸丙糖异构酶，402 bp）、yqiL（编码乙酰辅酶A乙酰转移酶，516 bp）。通过PCR扩增上述7个管家基因，并对PCR产物进行测序，测序由广州赛默飞世尔科技公司完成。所获扩增序列先在pubmlst网站（https://pubmlst.org）进行比对分析，获得对应的基因序列号；再将得到7个基因序列号通过Search by combinations of MLST alleles进行比对，如菌株等位基因号的排列和公共数据库匹配上，即可得到菌株的ST型；如菌株由于等位基因序号的排列和公共数据库未匹配上，即可获得新的ST型。

1.2.5 耐药性测定 选择氯霉素、青霉素G、环丙沙星、克林霉素、磺胺甲恶唑、四环素、庆大霉素、万古霉素、利福平等9种抗生素，药敏试验采用K-B纸片扩散法，参考美国临床实验室标准化委员会（CLSI）文件（2018 版）进行[11]。于37 ℃恒温培养箱中震荡培养（150 r/min）6 h，测定OD600的值，并调节其至0.5，取100 μL金黄色葡萄球菌菌液涂布于BHI固体培养基，贴上100 μg抗生素纸片，每个平板上均分三等份，贴三种不同的抗生素片，对分离菌株进行药敏分析，对3种及以上抗生素同时耐药即为多重耐药菌株。

表1 九种肠毒素基因的PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences of nine enterotoxin genes

表2 金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布情况Table 2 Distributions of enterotoxin gene from Staphylococcus aureus

1.3 数据处理

所有数据采用Microsoft Office Excel 2007进行数据统计分析，并且使用word 2003进行三线表的绘制，采用Origin8.0进行柱状图的绘制工作。

2 结果与分析

2.1 金黄色葡萄球菌分离菌株肠毒素基因检出及分布情况

本研究针对所采集的260份样本进行金黄色葡萄球菌的分离检测，其中38份呈阳性，检出率为14.62%。金黄色葡萄球菌肠毒素包含经典肠毒素基因与新型肠毒素基因，本研究选择5种经典肠毒素基因（sea、seb、sec、sed和see）与4种型新肠毒素基因（seg、seh、sei、sej）进行PCR检测，确定其在38株金黄色葡萄球菌中的检出及分布情况。肠毒素基因分布情况见表2、图1。

图1 两种及两种以上金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布情况Fig.1 Distributions of two or more enterotoxin genes from Staphylococcus aureus

在被检测的38株金黄色葡萄球菌里，24株检出含有肠毒素基因，肠毒素基因检出率为63.16%。共检测到7种毒素基因型，其中sed检出率最高，有23株（60.53%），而新型肠毒素基因则是seg检出率最高，有10株，约占26.32%。其中，携带有两种以上肠毒素基因的菌株为14株（36.84%），有6株同时含有4种肠毒素基因（15.79%）。

2.2 金黄色葡萄球菌分离菌株的MLST分型分布

MLST结果见表3。在24株带有肠毒素的金黄色葡萄球菌分离株中，有16株菌为ST7型菌株，其次为5株ST5和3株ST464型菌株。

表3 金黄色葡萄球菌分离菌株MLST分型检测结果Table 3 The ST of Staphylococcus aureus strain with enterotoxin

2.3 金黄色葡萄球菌分离菌株耐药性分布

采用氯霉素、青霉素G、环丙沙星、克林霉素、磺胺甲恶唑、四环素、庆大霉素、万古霉素、利福平等9种抗生素对260份样本检测出的38株金黄色葡萄球菌进行药敏分析，耐药率见表4，多重耐药谱见图2。

由表4可知，38株分离菌株均对万古霉素敏感，对青霉素G、环丙沙星、克林霉素、四环素的耐药率较高，分别为86.84%（33/38）、60.53%（23/38）、55.26%（21/38）和52.63%（20/38），均已超过50%；其他依次是磺胺甲恶唑44.74%（17/38）、庆大霉素26.32%（10/38）、氯霉素23.68%（9/38）、利福平5.26%（2/38）；抑菌效果最好的抗生素是万古霉素、利福平、庆大霉素、氯霉素。由图2可以看出，对3种抗生素耐药的金黄色葡萄球菌有7株，占18.42%，对4种抗生素耐药的金黄色葡萄球菌有6株，占15.79%；对5种抗生素耐药的金黄色葡萄球菌有9株，占23.68%；对6种抗生素耐药的金黄色葡萄球菌有3株，占7.89%；多重耐药率（≥3种抗生素）达65.78%。

表4 金黄色葡萄球菌分离菌株药敏分析结果Table 4 Results of drug susceptibility analysis of isolated strains from Staphylococcus aureus

图2 金黄色葡萄球菌分离菌株多重耐药谱Fig.2 Multiple resistance spectrum of isolated strains from Staphylococcus aureus

3 讨论与结论

本研究对鸡肉加工环节进行采样（包括肉表面和加工环境），采集了260份样品，结果显示38份样品中检测出金黄色葡萄球菌，检出率为14.61%，而国内近期文献报道检出率为16.51%、46%、23.4%、24.2%[17-20]，由此可见，国内取样基本上是市场上的鲜、冻鸡肉，在流通、销售过程中会存在二次污染。选择sea、seb、sec、sed、see、seg、seh、sei、sej9种肠毒素基因进行PCR检测，有24株被检出含有肠毒素基因，肠毒素基因检出率为63.16%。共检测到7种毒素基因型，其中经典肠毒素基因检测出4种，sed为 60.53%，see为 21.05%，sec为 10.53%，sea为7.89%，已知文献报道也检测出了相关肠毒素基因[21]。尽管经典肠毒素基因被认为是食物中毒的主要病因，但本研究还检测出3种新型肠毒素基因，其中seg检出率为26.32%，sei为18.42%；肠毒素具有遗传多样性与相关性，seg与seb、sec结构相似（氨基酸同一性为38%～42%），sei与sea、see、sed结构相似（氨基酸同一性为26%～28%），这两个肠毒素基因在肠毒素基因间的系统发育上起重要作用，但目前尚不完全了解这些新型肠毒素与食物中毒之间的联系[22-23]。因此，有必要加强鸡肉制品中seg、sei的检测，注意其携带率趋势的变化，加强其致毒机理及遗传相关性的研究，以防止食物中毒的发生。

MLST分型是一种被广泛接受的基于DNA序列的分型方法，7个管家基因可以提供独特的等位基因谱作为序列类型，获得的数据具有很高的可重复性，适合用于长期的监测菌群结构变化，研究地域性传播和流行性变迁。对24株带有肠毒素金黄色葡萄球菌进行MLST分型后显示，16个菌株为ST7型，5个菌株为ST5型，3个菌株为ST464型。我国对鸡肉制品的生产过程的研究较少，对比国外结果，美国研究者在鸡和火鸡中所携带的金黄色葡萄球菌中鉴定出ST5和ST398两种序列型[24]；比利时研究者在活鸡中检测出ST398[25]；而国内主要是对引起食源性中毒的金黄色葡萄球菌进行MLST分型，目前鉴定出的序列型主要是ST1、ST5、ST6、ST7、ST9、ST15、ST30、ST59、ST72、ST88、ST97、ST338、ST398、ST464、ST804、ST1003[26]。本研究结得到ST5、ST7、ST464的序列型符合目前国内鉴定得到的序列型，卫沛楠从石家庄地区食物中毒样品中分离得到的金黄色葡萄球菌，进行MLST分型，ST5序列型有5株、ST7序列型有2株、ST464序列型有3株[27]；颜文光从扬州市农贸市场和超市食物中分离得到的金黄色葡萄球菌存在5株ST7型[28]。

近年来由于抗生素大量应用于畜牧业的生产，导致金黄色葡萄球菌对抗生素耐药性不断提高。自从1996年第1例耐药性金黄色葡萄球菌报道以来，在肉类、乳类、水产品等动物源食品或包含动物源的食品都检测出耐药性金黄色葡萄球菌菌株[29-31]。1995～2005年，美国广泛将氟喹诺酮类药物用于肉鸡生产中，导致耐氟喹诺酮类金黄色葡萄球菌流行[24]。本研究选择氯霉素、青霉素G、环丙沙星、克林霉素、磺胺甲恶唑、四环素、庆大霉素、万古霉素、利福平等9种抗生素对分离菌株进行药敏分析，发现38株金黄色葡萄球菌分离菌株均对万古霉素敏感，这与相关文献报道一致[32]，说明万古霉素是目前用来对付金黄色葡萄球菌感染的最强有力抗生素药物。本研究还发现金黄色葡萄球菌对青霉素G、环丙沙星、克林霉素、四环素的耐药率较高，与国内外文献相比，既有一致性，又有一定差异。如Waters等报道，鸡肉中金黄色葡萄球菌普遍对喹诺酮类、四环素、氨苄青霉素、青霉素、红霉素具有耐药性[24]；徐本锦等研究发现，鸡肉中金黄色葡萄球菌对红霉素、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑、四环素、阿米卡星、环丙沙星、苯唑西林、阿莫西林的耐药性较高[32]；宋康研究发现，鸡肉中金黄色葡萄球菌对四环素、红霉素、氟哌酸、复方新诺明、杆菌肽、链霉素、罗红霉素具有耐药性[33]；Lin等研究发现，鸡肉中金黄色葡萄球菌对克林霉素、四环素、氯霉素，红霉素、泰乐菌素的耐药性非常普遍[34]；以上学者研究中，从鸡肉中分离出的金黄色葡萄球菌普遍对四环素、青霉素等常见的抗生素具有耐药性，但也存在只对特定抗生素存在耐药性的情况，如Sarah等研究证实，来自鸡屠宰场金黄色葡萄球菌分离株仅对β-内酰胺类和氟喹诺酮类耐药[35]。总体来看，各类研究均发现金黄色葡萄球菌普遍对β-内酰胺类、四环素类、氟喹诺酮类药物具有耐药性，但不同研究有一定差异，出现上述差异原因可能与肉鸡饲养环境及生长过程中抗生素的使用种类有关。

本研究从鸡肉制品中分离得到的携带毒素基因的金黄色葡萄球菌中，其MLST分型都为ST序列型，且均对万古霉素有耐药性，ST464与ST7型菌株多重耐药性相对较高，如3个ST464型菌株分别对4～6种抗生素具有耐药性；几乎所有ST7型菌株均对3种及以上抗生素具有耐药性，但不同菌株耐药性没有一定规律性。ST464型菌株主要含有sea、sed、see肠毒素基因，ST7型普遍含有sed肠毒素基因，由此可以推断含有sed基因的菌株有可能是引起金黄色葡萄球菌多重耐药性的主要因素。以往的研究证实，金黄色葡萄球菌之所以存在耐药性是由于其含有耐药基因，耐药基因有的位于质粒上，有的位于染色体上，前者居多，耐药基因位于质粒上比定位于染色体上更易使抗药性传播[27]。基于目前的数据可以推测，sed基因与耐药基因有可能同样位于质粒上，从而产生菌株的多重耐药性，具体原因还有待于进一步研究证实。

鸡肉制品生产过程中会存在金黄色葡萄球菌污染的情况，本研究从鸡肉加工环境中的260份样品中检测到出38株金黄色葡萄球菌分离菌株，这些菌株中有24株（63.16%）都携带了毒素基因，且携带毒素基因菌种的MLST分型都为ST型，其中ST7型菌株最多。有超过一半的菌株都对抗生素敏感，其中抑菌效果最好的抗生素是万古霉素，有25株（65.78%）存在着多重耐药性。因此，应加强鸡肉制品生产的监管，重视细菌耐药性监测，避免相关耐药菌株的出现，加强鸡肉产品生产过程中关键污染环节控制，加强对加工操作人员的规范管理和监督，确保食品与公共卫生安全。