龙牙楤木中酚类物质提取方法的比较

朱定波，徐 卫

（重庆市第九人民医院药剂科，重庆 400700）

龙牙楤木（Aralia elata（Miq.） Seem.），别称刺老芽，刺龙芽，是五加科（Araliaceae）楤木属（Aralia）植物，广泛分布于亚洲地区，在我国东北三省储量极为丰富[1]。龙牙楤木是药，食兼用植物，其根，树皮，叶具有补气安神，活血通络，除湿止痛等功效[2]。常用于滋补，治疗关节炎、神经衰弱、糖尿病、肝炎、心肌缺血等症[3]。其嫩芽中含有人体必需的多种氨基酸和微量元素[4-5]。近年来，关于龙牙楤木的研究，主要集中在对其皂苷类化合物的分离、鉴定及药理活性等相关研究[6-10]，以及具有抗辐射损伤、抗肿瘤及抗氧化等作用的多糖[11-12]，而对其酚类物质研究较少[13-14]。

多酚是一类广泛存在于植物体内的复杂酚类次生代谢产物，具有独特化学结构，在抗氧化、抑菌、延缓衰老、抑制心血管疾病及抗癌等方面表现出显著功效[15-16]。因多酚在自然界分布的广泛、储量的丰富、生理功能的多样，农业、林业、食品、医药等领域的众多学者对多酚进行了基础和应用研究[17]，其在医药、食品、保健品及日用化学品等方面得到了广泛应用。

本文采用溶剂浸提法、溶剂回流法、超声辅助法、微波辅助法及复合酶法，提取龙牙楤木中酚类物质，分析不同提取方法对龙牙楤木中酚类物质得率的影响，并利用正交试验优化提取工艺，确定最佳提取工艺参数，为开发利用龙牙楤木中酚类物质提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

龙牙楤木嫩叶 于2019年5月中旬采自吉林白山长白朝鲜族自治县，由西北农林科技大学生物学博士后徐洪宇鉴定为五加科植物龙牙楤木（Aralia elata(Miq.) Seem.）的叶片，45 ℃干燥、粉碎，过80目筛备用；复合植物水解酶ViscozymeL（非淀粉复合糖酶，含果胶酶和各种碳水化合物酶，包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和木聚糖酶等）诺维信中国生物技术有限公司；福林酚 天津市大茂化学试剂厂；没食子酸、芦丁 国药集团化学试剂有限公司；亚硝酸钠、无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠等

均为分析纯。

FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；KQ3200DE型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；722s可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司；FA1004A型分析天平 上海精天电子仪器；RE-52AA型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；DK-98-ⅡA型恒温水浴锅 天津泰斯特仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 不同提取方法对龙牙楤木中酚类物质含量的影响

1.2.1.1 溶剂浸提法提取 参考Paz等[18]方法略作修改。称取龙牙楤木粉末0.500 g于锥形瓶中，加10 mL体积分数为70%的乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），在室温条件下浸提12 h，抽滤，收集提取液。重复上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，备用，测其总酚、总黄酮得率。

1.2.1.2 溶剂回流法提取 参考Paz等[18]方法，略作修改。称取龙牙楤木粉末0.500 g于250 mL圆底烧瓶中，加100 mL体积分数为70%的乙醇溶液（料液比为1:200 g/mL），加沸石，在80 ℃恒温水浴锅中回流1 h，抽滤，收集提取液。重复上述提取3次，合并提取液，浓缩，定容至50 mL，备用，测其总酚、总黄酮得率。

1.2.1.3 超声辅助法提取 参考Persic等[19]方法，略作修改。称取龙牙楤木粉末0.500 g于锥形瓶中，加10 mL体积分数70%乙醇溶液（料液比1:20 g/mL），超声（150 W）提取30 min，超声温度50 ℃，抽滤，收集提取液。重复上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，备用，测其总酚、总黄酮得率。

1.2.1.4 微波辅助法提取 参考Alonso-Castro等[20]加10 mL体积分数为70%的乙醇溶液（料液比为1:20 g/mL），将锥形瓶置于微波炉中，在微波功率480 W，微波时间40 s，待样品溶液冷却至室温，抽滤，收集提取液。重复上述提取3次，合并提取液，定容至50 mL，备用，测其总酚、总黄酮得率。

1.2.1.5 复合酶法提取 参考朱建星等[21]方法，略作修改。称取龙牙楤木粉末0.500 g于锥形瓶中，加10 mL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液（料液比1:20 g/mL），pH为4.0，加入复合植物水解酶120 μL/g（酶量/样品量），50 ℃条件下酶解2 h，90 ℃水浴灭酶10 min，抽滤，收集提取液，滤渣中加入10 mL体积分数为70%的乙醇溶液，室温浸提1 h，抽滤，收集提取液。重复上述提取3次，合并提取液，浓缩，定容至50 mL，备用，测其总酚、总黄酮得率。

1.2.2 复合酶法提取单因素实验 在酶解pH为4.0，分别加入80、100、120、140、160 μL/g复合植物水解酶，50 ℃条件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提滤渣，考察酶用量对酚类物质得率的影响。

在酶解pH为4.0，酶用量120 μL/g，分别在20、30、40、50、60 ℃条件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提滤渣，考查酶解温度对酚类物质得率的影响。

在酶解pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，酶用量120 μL/g，50 ℃条件下酶解1 h，70%乙醇溶液浸提滤渣，考查pH对酚类物质得率的影响。

在酶解pH为5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃条件下酶解0.5、1、1.5、2、2.5 h，70%乙醇溶液浸提滤渣，考查酶解时间对酚类物质得率的影响。

在酶解pH为5.0，酶用量120 μL/g，50 ℃条件下酶解1.5 h，体积分数为40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液浸提滤渣，考查乙醇体积分数对酚类物质得率的影响。

1.2.3 复合酶法提取正交试验 根据单因素实验结果，以总酚、总黄酮得率为考察指标，设计L16（35）正交试验，确定最优酶解提取工艺。因素水平见表1。

1.2.4 酚类物质含量测定

1.2.4.1 总酚含量的测定 采用Folin-Ciocalteu测定法[22]：分别取0.2 mL样品或不同浓度的没食子酸标准溶液于试管中（空白组用70%乙醇代替），加入0.1 mol/L的福林酚2.5 mL，5 min后加入7.5% Na2CO3溶液2.5 mL，在室温避光下反应2 h，于725 nm波长下测定其吸光度，绘制不同浓度的没食子酸标准溶液（x）与对应吸光度（y）之间的标准曲线y=2.105x+0.1538（R²=0.9992）。根据标准曲线，按公式（1）计算总酚得率（%）。

表1 正交试验因素及水平设计Table 1 Factors and levels of extraction experiment

式中：C为没食子酸质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液的总体积，mL；m为龙牙楤木样品质量，g。

1.2.4.2 总黄酮含量的测定 参照文献[23]，吸取1 mL样品或不同浓度的芦丁标准溶液于试管中（空白组用70%乙醇代替），加入4 mL 70%的乙醇溶液，0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液；6 min后加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液；6 min后再加4 mL 1 mol/L的氢氧化钠溶液，0.4 mL水，放置15 min，于510 nm波长下测定其吸光度，绘制不同浓度的芦丁标准溶液（a）与对应吸光度（b）之间的标准曲线y=0.6446x+0.1726（R²=0.9991）。根据标准曲线，按公式（2）计算总黄酮得率（%）。

式中：C为芦丁质量浓度，mg/mL；n为提取液稀释倍数；V为提取液的总体积，mL；m为龙牙楤木样品质量，g。

1.3 数据处理

试验数据使用SPSS 22软件进行统计分析，采用SNK法进行显著性检验（P＜0.05），每个样品重复3次试验，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 不同提取方法比较

采用溶剂浸提法、溶剂回流法、超声辅助法、微波辅助法及复合酶法，共5种方法提取龙牙楤木中酚类物质，以总酚和总黄酮得率作为考察指标，实验结果见表2。

不同提取方法提取酚类物质的原理不同，溶剂浸提和溶剂回流法提取均是利用相似相溶原理对目标成分进行提取的方法。溶剂回流法相较于溶剂浸提法增加了提取温度，有利于酚类物质的溶出，表2中，溶剂回流法得到的总酚、总黄酮得率（2.38%，1.05%）高于溶剂浸提法（1.95%，0.96%）；超声辅助法提取是利用超声波形成的空化效应，使植物组织细胞产生破裂，释放内容物，加速提取过程，提高提取效率，本实验中总酚得率为4.32%，总黄酮得率为1.52%；微波辅助法是利用微波在传递过程中穿透植物体，植物体吸收微波产生热能，使细胞内部水分气化，产生的压力使细胞膜破裂，内容物溶出，此方法得到的总酚得率为5.93%、总黄酮得率为2.25%；而复合酶法提取是利用植物复合酶（由纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶等组成的混合酶系），使细胞壁在酶的作用下软化、膨胀和崩溃等，进而改变细胞壁的通透性，从而提高目标物质的提取效率，通过复合酶法得到的总酚得率为7.09%、总黄酮得率为2.96%。

表2 不同提取方法中龙牙楤木的总酚、总黄酮得率Table 2 Extraction rate of total phenol and flavonoids from Aralia elata by different extraction methods

由表2中可知，不同提取方法得到的总酚、总黄酮得率差异显著（P＜0.05），其得率大小为：复合酶法＞微波辅助法＞超声辅助法＞溶剂回流法＞溶剂浸提法。本实验中复合酶法提取效果强于其他4种方法，此结果与王超等[24]比较了纤维素酶法和超声波法提取雀儿舌头中多酚，得出酶法较超声波法多酚得率提高，以及付晓燕等[25]也证明了酶辅助提取燕麦中酚类物质较溶剂法提取总酚含量更高，结果一致。

本实验通过5种提取方法的比较，得出复合酶法提取的酚类物质得率高，故选用复合酶法为最佳的提取龙牙楤木中酚类物质的方法，采用正交试验进一步对复合酶法提取的工艺进行优化。

2.2 复合酶法提取单因素实验结果

2.2.1 酶用量对酚类物质得率的影响 酶用量对龙牙楤木中酚类物质得率的影响，如图1所示，随着酶用量的增加，植物细胞壁破裂更彻底，酚类物质向溶剂中的扩散作用增强，总酚、总黄酮得率增大；当酶加入量增加到一定量后，其总酚、总黄酮得率达到最大，继续增加酶用量后，酶吸附在物料表面，影响酚类物质的扩散，总酚、总黄酮得率下降。因此，酶用量为120 μL/g时，酚类物质提取效果最佳。

2.2.2 酶解温度对酚类物质得率的影响 酶解温度对龙牙楤木中酚类物质得率的影响，由图2可知，随酶解温度升高，龙牙楤木中总酚、总黄酮得率增大，且在50 ℃时得率最高。这是由于复合酶酶解活力在一定温度范围内随温度升高而增强，酶反应速率加快；当温度继续升高时，酶活性降低，酚类物质得率下降[26]。故选取50 ℃为最佳酶解温度。

图1 酶用量对酚类物质得率的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on extraction rate of phenolic compounds

图2 酶解温度对酚类物质得率的影响Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of phenolic compounds

2.2.3 pH对酚类物质得率的影响 pH过低或者过高都会影响酶的活力，从而影响酶对植物细胞壁的降解作用，最终影响酚类物质的提取。pH对龙牙楤木中酚类物质得率的影响，由图3可知，当酶解pH小于5时，随pH增大龙牙楤木中总酚、总黄酮得率增大，当pH继续增大后，可能影响酶结构和底物的解离，影响总酚、总黄酮的得率。故本实验最佳酶解pH为5。

图3 pH对酚类物质得率的影响Fig.3 Effect of pH on extraction rate of phenolic compounds

2.2.4 酶解时间对酚类物质得率的影响 酶解时间对龙牙楤木中酚类物质得率的影响，由图4可知，随酶解时间的增加，酚类物质得率呈先增加后降低，达到1.5 h时，酚类物质得率达到最大值；当继续延长酶解时间，总酚、总黄酮得率变化较小，这是因为复合酶在作用一定时间后，细胞内外的酚类物质浓度达到动态平衡，综合考虑，选择最佳酶解时间1.5 h。

图4 酶解时间对酚类物质得率的影响Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis time on extraction rate of phenolic compounds

2.2.5 乙醇体积分数对酚类物质得率的影响 乙醇体积分数对酚类物质得率的影响，由图5可知，乙醇体积分数为40%～80%范围内，总酚、总黄酮得率呈先增加后减小的趋势，主要是因为当乙醇体积分数达到50%后，一些醇溶性杂质溶出增加，色素等亲脂性强的成分，影响了酚类物质的浸出，致使总酚、总黄酮得率下降，故选用体积分数50%的乙醇为最佳。

图5 乙醇体积分数对酚类物质得率的影响Fig.5 Effect of ethanol volume fraction on extraction rate of phenolic compounds

2.3 复合酶法提取正交试验结果

以总酚得率为指标，得到正交试验结果（表3，表4），由表3中极差分析可知，各因素对复合酶法提取龙牙楤木中总酚，其影响得率的大小次序为：A＞B＞E＞D＞C，即加酶量＞酶解温度＞乙醇体积分数＞酶解时间＞酶解pH。通过K值大小得到，最佳工艺组合为A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解温度50 ℃，酶解pH 6，酶解时间为1.5 h，乙醇浓度为50%；方差分析结果如表4所示，因素A加酶量、因素B酶解温度对总酚得率有极显著的影响（P＜0.01），因素D酶解时间、因素E乙醇体积分数对总酚得率有显著影响（0.01≤P＜0.05），因素C酶解pH对总酚得率无显著影响。因此，采用复合酶法提取龙牙楤木中总酚时，为达到最佳提取效果，需要重点控制加酶量和酶解温度，其次酶解时间以及乙醇体积分数。

表4 方差分析Table 4 Variance analyses

以总黄酮得率为指标，得到正交试验结果（表3，表4），由表3中，极差分析可知，各因素对复合酶法提取龙牙楤木中总黄酮，其影响得率的大小次序为：A＞B＞C＞E＞D，即加酶量＞酶解温度＞酶解pH＞乙醇体积分数＞酶解时间。通过K值大小得到，最佳工艺组合为A2B2C3D2E2，即酶用量120 μL/g，酶解温度50 ℃，酶解pH6，酶解时间为1.5 h，乙醇浓度为50%；方差分析结果（表4）显示显示因素A加酶量对黄酮得率有极显著的影响（P＜0.01），因素B酶解温度、因素C酶解pH、因素E乙醇体积分数对总黄酮得率有显著影响（0.01≤P＜0.05），因素D酶解时间对总黄酮得率无显著影响。因此，采用复合酶法提取龙牙楤木中总黄酮时，为达到最佳提取效果，需要重点控制加酶量，其次酶解温度、乙醇体积分数以及酶解pH。

2.4 验证实验

按照优化得到的最佳工艺组合A2B2C3D2E2进行重复性试验3次，总酚、总黄酮的平均得率分别为7.24%、3.17%，RSD值分别为0.73%、0.36%，高于按正交试验中的最高值7.04%、3.08%，RSD值分别为0.57%、0.32%。

3 结论

采用5种不同的提取方法对龙牙楤木中酚类物质进行提取，以总酚、总黄酮得率为考察指标，得率依次为：复合酶法＞微波辅助法＞超声辅助法＞溶剂回流法＞溶剂浸提法。利用正交试验优化复合酶法提取工艺，得到酶用量120 μL/g，酶解温度50 ℃，酶解pH6，酶解时间1.5 h，乙醇体积分数50%，此工艺条件下，龙牙楤木中总酚得率为7.24%，总黄酮得率为3.17%，提取过程中需要重点控制加酶量和酶解温度。

本研究利用复合酶法提取龙牙楤木中酚类物质，提取过程温度低，对酚类物质化学结构影响小，酚类物质得率高，具有一定的实际价值。但本文仅对5中提取方法的单独提取效果进行了研究，在后续的实验过程中可以对不同方法进行联合，例如复合酶法与微波辅助法联合进行提取，期望进一步提高龙牙楤木中酚类物质的得率。