蕙兰种子根状茎培养与愈伤组织诱导

吴正景，高 文，马鑫婷，高屹典，刘亚楠，杨芯贤，安冰洁

(1.河南科技大学 园艺与植物保护学院，河南 洛阳 471003;2.河南后博农业科技有限公司，河南 洛阳 471003)

蕙兰(CymbidiumfaberiRolfe)为兰科(Orchidaceae)兰属(Cymbidium)地生草本植物，花葶从叶基部抽出，几乎直立或稍外露，花大多为浅黄绿色，具5～11朵或更多花的总状花序，通常有香气，在我国北方地区长势优于春兰。

目前关于蕙兰组培方面的研究报道较少，主要因为蕙兰对组培的条件要求较其他国兰品种更为复杂，对其他国兰的培养基配方适用性较差，在组培过程中容易发生褐化等问题。陈晓梅利用蕙兰茎尖为外植体材料，通过诱导原球茎的形成建立起蕙兰的离体快繁体系[1]；关仕港等人对金蕙进行了生根实验，得到了最适合生根的培养基配方[2]；黄江等人用花茎和花芽，成功诱导出惠兰的愈伤组织[3]；付秀琴发现在1/2MS培养基上，蕙兰种子萌发率可达80%[4]。笔者通过种子无菌萌发，探讨蕙兰种子根状茎的增殖、愈伤组织诱导条件。

1 材料与方法

1.1 试验材料

蕙兰种子采集自河南省南阳市桐柏县，经河南科技大学园艺植物生物技术研究室无菌萌发，获得蕙兰种子根状茎。

1.2 试验方法

1.2.1 根状茎增殖 蕙兰萌发种子根状茎诱导培养基为1/2 MS，添加蔗糖 20 mg·L-1，琼脂 7.0 g·L-1，pH=5.7，激素处理见表1。每处理接种4瓶，重复3次。60 d后测定其根状茎总数、分支数、增加长度、增殖率、褐变数、生长状况6项指标。

表1 蕙兰根状茎增殖培养基

1.2.2 根状茎分化出芽 蕙兰根状茎芽诱导培养基为MS，蔗糖15 mg·L-1，葡萄糖15 mg·L-1，琼脂7.0 mg·L-1，pH=5.7，激素配方见表2。每处理接种3～4瓶，重复3次。40 d后测定其平均芽数、出芽率、平均长度、平均长叶数、褐化率、生长状况。

表2 蕙兰芽诱导培养基

1.2.3 根状茎愈伤组织的诱导 接种时在惠兰根状茎表面划出一个甚至多个伤口，以利于诱导愈伤组织的形成。每处理接种3～4瓶，重复3次。接种30 d后观察愈伤诱导率、愈伤大小(长度)、生长状况、褐化率、出芽率。

表3 蕙兰根状茎诱导愈伤组织培养基

续表3 蕙兰根状茎诱导愈伤组织培养基

2 结果与分析

2.1 不同有机添加物对蕙兰根状茎增殖的影响

由表4可知，添加香蕉泥的培养基比添加土豆泥的培养基，其上惠兰根状茎的增殖率、增加的长度、分支数更高，褐变数更少。因此，添加香蕉泥的培养基比添加土豆泥的培养基更适合惠兰根状茎的增殖。

表4 不同培养基对根状茎增殖的影响

2.2 不同培养基对蕙兰根状茎分化出芽的影响

由表5可知，当培养基中的NAA浓度为2.0 mg·L-1时，惠兰根状茎出芽率均比接种于NAA1.0 mg·L-1的惠兰根状茎要长，同时其褐化率更低，生长状况也较好。Y8处理中出芽率最高，达到87.5%，平均芽数为10.1，没有出现褐化，说明培养基中单独添加酪蛋白对蕙兰出芽不利，而蛋白胨和酪蛋白同时添加时效果最好。

表5 不同培养基对蕙兰根状茎诱导出芽的影响

2.3 根状茎的愈伤诱导

由表6可知，单独添加2,4-D和单独添加NAA的培养基均能诱导出愈伤组织，且当2.4-D的浓度为1.0 mg·L-1时，愈伤组织的诱导率可达33.3%；激素配方 0.5 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-12,4-D+6-BA1.0 mg·L-1诱导的愈伤活力较好；添加椰汁对诱导愈伤组织效果不明显；培养基中加入1.0 g·L-1蛋白胨时，对于诱导惠兰愈伤组织的形成效果最好，且诱导率比加入其他添加物的培养基要高，活力更强，且褐化率较低；KT对愈伤的诱导作用效果一般。

表6 不同培养基对蕙兰诱导愈伤组织的影响

总之，在本次试验中，蕙兰诱导愈伤组织效果最好的培养基配方是GY15，其诱导愈伤率为45.0%，愈伤为绿色，没有褐化现象的产生。

3 结论与讨论

3.1 结论

添加香蕉泥的培养基比添加土豆泥培养基更适合惠兰根状茎的增殖；诱导蕙兰根状茎分化出芽的最佳培养基配方为:MS + 2.0 mg·L-1NAA + 4.0 mg·L-16-BA + 1.0 g·L-1酪蛋白 + 1.0 g·L-1蛋白胨 + 15 g·L-1蔗糖+15 g·L-1葡萄糖 + 7.0 g·L-1琼脂；诱导根状茎诱导愈伤组织形成的最适培养基配方为：MS + 0.5 mg·L-12,4-D + 1.0 mg·L-1NAA + 1.0 mg·L-16-BA +100 g·L-1椰汁 +30g·L-1蔗糖+7.0g·L-1琼脂。

3.2 讨论

2,4-D可以增加蕙兰根状茎的愈伤组织诱导率，但需要2,4-D和其他生长素及细胞分裂素配合使用，效果更好。

Samira Chugh等研究中表明，椰汁包含多种营养和激素，经过高压灭菌后与兰花组培培养基的其他活性物质相容性高，能够刺激愈伤组织或者原球茎的形成，提高细小片段外植体的存活率，调整原球茎分化过程[5]。笔者试验发现 1.0 g·L-1的蛋白胨对诱导愈伤的效果最好，比加100 mL·L-1椰汁的效果更好。在诱导蕙兰根状茎出芽过程中，1.0 g·L-1蛋白胨和 1.0 g·L-1酪蛋白混合使用比单独使用效果更好。