吡虫啉对链格孢菌生长和繁殖的影响

许 静，徐玲玲，张梦琦

(植物与微生物协同研究实验室，西安文理学院 生物与环境工程学院，陕西 西安 710065)

前言

吡虫啉是德国拜耳公司在20世纪八十年代研发的一种高效低毒杀虫剂, 对刺吸式口器害虫如蚜虫和叶蝉及鞘翅目害虫有非常好的防治效果，目前已在超过80 个国家的60 种农作物上使用, 年使用量高达1 000～30 000 t，世界销售额达9.2亿美元[1，2]。作为一种硝基亚甲基类氯代尼古丁杀虫剂，吡虫啉作用于昆虫的烟酸乙酰胆碱酶受体的作用体，通过干扰昆虫的神经刺激传导系统,使烟碱酶受体的神经通路梗阻，进而破坏其神经系统，致使昆虫麻痹，并最终导致昆虫死亡[2]。吡虫啉具有触杀、胃毒和内吸等多重作用，所以无论害虫吸食或者接触都可有效防治。有意思的是，除了杀虫外，仪美芹等人[3]研究表明吡虫啉还可以提高番茄的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性，从而提高植物根系活力。另外，刘中良等人[4]研究表明吡虫啉在适宜浓度下可以促进番茄的生长进而提高其逆境屏蔽效应。值得注意的是，还有研究表明吡虫啉可以诱导植物的系统获得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)，从而增强植物对病原菌的抗性[5，6]。这些研究说明吡虫啉可以直接作用于植物，促进其生理生长并增加其对生物逆境或非生物逆境的抗性。但是，目前还未有报道吡虫啉是否可以直接作用于病原菌的生长繁殖。因此，笔者以一种能引起众多植物病害的病原性真菌链格孢菌(Alternariaalternata)为研究对象，检测了吡虫啉对其菌丝生长和形态以及产孢子的作用，揭示了吡虫啉对植物病原真菌生长繁殖的影响，探讨其用于植物抗病的可能性。

1 材料与方法

1.1 菌种来源及培养

所用链格孢菌来源于西北师范大学马宗旺博士的馈赠。链格孢菌培养用PDA培养基(马铃薯200 g·L-1, 葡萄糖20 g·L-1， 琼脂15 g·L-1)，置于28℃恒温培养箱倒置培养。

1.2 吡虫啉的使用

吡虫啉粉剂购于Dr Ehrenstorfer GmbH。用甲醇溶解配制成10 g·L-1的母液，用0.22 μm无菌过滤器过滤灭菌后置于-20℃保存。使用时先室温解冻，然后按浓度稀释比例加入50℃左右培养基中，混匀后倒平板，待平板冷却凝固后使用。

1.3 菌丝生长速度和形态的检测

菌种在PDA培养基上活化后，用直径为1 cm的打孔器取边缘菌丝琼脂块，置于平板中心后培养，每隔两天用十字交叉法测量菌落生长直径，直到长满整个平板。

待长出新鲜菌丝后，每隔两天在超净台下用接种针挑取少量菌丝在滴有一滴灭菌蒸馏水的玻片上，盖上盖玻片后在显微镜下观察菌丝形态。

1.4 产孢子实验

接种平板待其菌丝长满整个平板后，继续培养1周后测定其产孢子数量。每个平板用15 mL孢子冲洗液(含有6.67 mM 葡萄糖和10 mM 磷酸二氢钾)冲洗孢子，双层纱布过滤菌丝后用血球计数板统计孢子数量。

1.5 数据统计及分析

所有数据均采用使用Excell和SPSS18进行分析和图表制作。

2 实验结果与分析

2.1 吡虫啉对链格孢菌生长的影响

为了探索吡虫啉对链格孢菌生长的影响，首先用添加不同浓度吡虫啉的PDA培养基培养链格孢菌，以添加吡虫啉溶剂甲醇为对照，培养4 d后测量各处理下菌落生长直径。结果如图1所示，5 mg·L-1的吡虫啉对链格孢菌生长没有明显作用，但20 mg·L-1和100 mg·L-1的吡虫啉显著显著性地抑制了链格孢菌的生长，且抑制作用随浓度增加而变强。因此，后续采用了20 mg·L-1的浓度进行验证。如图2所示，与空白对照相比，添加等量甲醇对链格孢菌的生长无明显作用，说明吡虫啉溶剂甲醇对链格孢菌的生长无明显影响。但是在培养的第4、6、8天，添加吡虫啉的培养基上菌落直径均显著性小于添加甲醇的培养基上的菌落，说明吡虫啉在20 mg·L-1时即可显著性地抑制链格孢菌的生长，因此后续实验也都采取了该浓度。

图1 不同浓度吡虫啉对链格孢菌生长的影响

图2 吡虫啉对链格孢菌生长的影响

图中所示数值为培养4 d时10个平板的菌落直径平均值 ± 标准差，不同字母表示有显著性差异(ANOVA，P<0.05)。

A. 链格孢菌在添加20 mg·L-1的吡虫啉、等量溶剂甲醇和空白对照培养基上培养2、4、6、8 d时菌落的直径。图中所示数值为10个平板的菌落直径平均值 ± 标准差，该实验重复了3次，结果相似。星号表示对比甲醇组差异显著(T-test,P<0.05)。B. 链格孢菌在培养8d后菌落照片，上为平板正面，下为平板背面，从左至右分别为：空白对照、甲醇对照和吡虫啉处理。

2.2 吡虫啉抑制链格孢菌菌丝形态的影响

为了进一步研究吡虫啉对链格孢菌生长的影响，我们在显微镜下观察了添加20 mg·L-1吡虫啉和等量溶剂甲醇培养基培养的菌丝形态。如图3所示，吡虫啉处理下菌丝明显更加纤细，且有部分畸形，说明吡虫啉不仅减缓了链格孢菌的生长速度，还影响了其菌丝形态。

图3 链格孢菌在不同处理下的菌丝形态 (100 x)

A: 空白对照；B: 甲醇对照；C: 吡虫啉处理。

2.3 吡虫啉抑制链格孢产孢子

为了解吡虫啉对链格孢菌繁殖的影响，本研究检测了不同处理下链格孢菌产生的分生孢子数量。如表1所示，甲醇组产孢子数量随低于空白对照组，但差异不显著，而吡虫啉组的孢子数则显著性少于甲醇对照组，说明吡虫啉抑制了链格孢菌的产孢子这一繁殖过程。

表1 吡虫啉对链格孢菌产孢子的影响

3 结论

施用各种农药，包括杀虫剂和杀菌剂，是目前防治病虫害最主要和最有效的方法，但是存在很多滥用的问题，导致对环境的污染和种植成本的增加。据调查，我国农药的单位面积使用量处于较高水平, 约为世界平均水平的2.50倍[7]。而在2015年我国农业部就制定了《到2020年农药使用量零增长行动方案》，提出了科学用药的目标[8]。因此，农药的科学利用和使其功效最大化是亟需解决的问题。吡虫啉从开发以来一直是作为一种高效低毒的杀虫剂被广泛用于田间杀虫。笔者研究显示吡虫啉可以直接抑制植物病原真菌链格孢菌的生长和繁殖，说明吡虫啉还有可能作为抗菌剂使用。结合其它研究表明吡虫啉可以增强植物的抗病性，说明吡虫啉有潜力作为一种综合防治药剂，既能抗虫，又能抗病，一药多用。后续可结合田间实际虫害和病害的发生规律，优化其使用时间和剂量，达到环保和节约种植成本的双重目标。