基于网络药理学三叶汤治疗病毒性肺炎作用机制探讨

谢嘉嘉，张立

深圳市宝安中医院，广东 深圳 518100

病毒性肺炎是由上呼吸道出现病毒感染，病原体向下发展所致的肺部炎症，主要特征是干咳、咳痰、发热、气喘、肺部湿性啰音等。致病菌包括呼吸道合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、腺病毒、巨细胞病毒等，最为常见的是呼吸道合胞病毒［1］。

病毒性肺炎在中医学上属于“风温肺热”“疫病”“肺炎咳嗽”之类，其病机为邪热郁于肺，病位在肺，主要症状为咳、痰、热、喘［2］。若身体亏虚，正衰邪盛，易出现邪毒内陷、复感他邪、正气虚衰等［3］，故病情变化甚快，需要尽早干预。2019年的新型冠状病毒肺炎，同样是病毒性肺炎的一种，其感染病原体是β属冠状病毒，主要经呼吸道飞沫、气溶胶或密切接触传播，临床表现是发热、干咳、乏力等，发病早期会出现白细胞数正常或减少，淋巴细胞数正常或减少；新型冠状病毒核酸检测阳性或特异性抗体异常；胸部影像学出现以肺外带为主的多发斑片影或间质改变。新型冠状病毒肺炎属中医“疫病”相关范畴，即感受了“疫戾”之气发而为病，此次疫情中医药发挥了独特的优势［4］。中医药是以整体观念为本，通过辨证论治，针对具体病情调整用药，治疗疾病时具有显著的特色、疗效及优势［5］。

经岭南各代医家在止嗽散的基础上辨证加减而拟方的三叶汤［6］，主要遵循“疏风清热、润肺止咳”的治法，本研究的三叶汤是由广州中医药大学第一附属医院刘小虹教授根据临床经验进行药物加减而成，共12味中药，人参叶、龙脷叶、枇杷叶、浙贝母、苦杏仁、桔梗、牛蒡子、防风、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花。方中以人参叶、龙脷叶、枇杷叶三药共用为君，人参叶性寒，味苦、甘，归肺、胃经，可祛暑生津、补气益肺；枇杷叶，性味苦、微辛微寒，入肺、胃经，可清肺止咳、和胃降逆；龙脷叶是岭南的道地药材，性平，味甘、淡，归肺、胃经，可润肺止咳、通便；三者均可入肺经，清润上焦肺气。苦杏仁，苦降，止咳化痰、降逆平喘，为臣药；桔梗，辛散，开宣肺气，同杏仁合用，使肺得以宣降，故能止咳；防风为风中之润药，辛能散肝，香能舒脾，风能胜湿，走表而散风御邪；浙贝母，化痰止咳、清热散结，助杏仁止咳化痰；木蝴蝶，可清肺利咽和胃、疏肝。紫菀，苦、辛、甘、微温，归肺经，润肺化痰止咳；款冬花，化痰降气平喘，与紫菀相须为用，紫菀善于化痰，款冬花善于止咳，两者常配伍用。牛蒡子，辛凉，解毒利咽、疏散风热、清利头目；甘草调和诸药。全方共奏疏风宣肺、润肺止咳之功效，且在长期实践中证实该方有止嗽的疗效，被证实可用于治疗鼻后滴流综合征之慢性咳嗽、上气道咳嗽综合征、感染后咳嗽、咳嗽变异性哮喘等［7-9］。

网络药理学是基于系统生物学基础，对生物系统和疾病的网络聚类分析，选择特有的数据信号节点进行多靶点药物分子结构设计，进行综合分析的新学科。其基本原理是通过分析有效成分、基因、蛋白质、信号通路，建立网络模型及数据可视化，系统地展示中药、方剂药理作用及机制［10］。目前已被广泛应用于中药的基本药效、药效相关性及中药复方作用机制等［11］，可提高药物的治疗效果，减少药物不良反应，提高新型药物临床研究的成功率。

本研究运用网络药理学方法筛选了三叶汤的活性化合物和作用的靶点，并进行系统聚类分析，建立药物-化合物-靶点系统网络，同时分析信号通路，为三叶汤更广泛地应用于治疗病毒性肺炎提供理论依据。

1 方法

1.1 三叶汤所含药物的化合物收集和筛选应用中药系统药理学分析平台数据库（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）及Batman-TCM数据库以“人参叶”“枇杷叶”“龙脷叶”“苦杏仁”“浙贝母”“桔梗”“牛蒡子”“防风”“木蝴蝶”“紫菀”“甘草”“款冬花”为关键词进行分析，检索三叶汤中各药物的化合物成分。根据毒药动力学原理，口服生物利用度（oral bioavailability，OB），即制剂中药物被吸收进入人体循环的速度及程度，该数值越高表明该药物的生物活性分子类药性（durg-likeness，DL）则越好［12］。结合相关文献报道，借助TCMSP平台，以OB≥30%及DL≥0.18为基准，检索人参叶、枇杷叶、龙脷叶、苦杏仁、浙贝母、桔梗、牛蒡子、防风、木蝴蝶、甘草、紫菀、款冬花所含化合物，筛选出符合标准的活性成分。

1.2 筛选靶标蛋白及构建药物-化合物-靶点网络运用TCMSP平台，对三叶汤中筛查出的活性成分进行检索，查找与之对应的目标蛋白，使用Unpirot数据库（http：//www.uniprot.org/）查询靶标蛋白对应的基因，合并重复的靶点并删除无对应基因的蛋白。采用Cytoscape 3.7.2软件分析化合物及建立靶点网络。

1.3 预测三叶汤治疗病毒性肺炎的潜在作用靶点使用疾病靶点数据库（Genecards http：//www.genecards.org/）以“viral pneumonia”为关键词检索和病毒性肺炎相关联的疾病基因。将筛选得到的疾病靶点与药物靶点进行映射，从而选取三叶汤在治疗病毒性肺炎中的潜在作用靶点。

1.4 构建及分析PPI网络将以上步骤筛选得到的潜在作用靶点导入STRING数据库（https：//stringdb.org/），并设定物种为“Homo Sapiens”，从而获得蛋白与蛋白之间相互作用关系图，保存为TSV格式文件，将文件导入到Cytoscape3.7.2软件中，使用“network analyzer”功能分析其网络拓扑属性，筛选出核心靶点。

1.5 分析靶点通路为更好地了解所筛选出的三叶汤治疗病毒性肺炎的潜在作用靶点基因的功能及在信号通路中的作用，将靶基因导入Funrich 3.1.3软件，进行GO富集分析。GO富集分析分别选用生物过程（biological processes，BP），细胞功能（molecular function，MF），细胞组分（cell composition，CC），依其富集靶点数目排序，导出前10个条目的条形图。最后，把选出的靶基因导入STRING数据库（https：//string-db.org/），分析KEGG信号通路富集，通过Omicshare云平台（http：//omicshare.com/）的绘图工具绘制气泡图，使数据可视化。

2 结果

2.1 筛选三叶汤中活性化合物运用TCMSP数据库检索并筛选出三叶汤所含的化合物，以OB≥30%且DL≥0.18的基准，筛得三叶汤共含有活性化合物共239个，其中9个来自人参叶，18个来自枇杷叶，2个来自龙脷叶，19个来自苦杏仁，7个来自浙贝母，7个来自桔梗，8个来自牛蒡子，18个来自防风，18个来自木蝴蝶，92个来自甘草，19个来自紫菀，22个来自款冬花。表1为三叶汤中部分活性化合物的基本信息。

2.2 构建及分析药物-化合物-靶点网络运用Cytoscape 3.7.2软件构建三叶汤中药物-活性化合物-靶点相互作用网络图，见图1。该网络共有240个节点，包括1个疾病名称节点、1个药物名称节点、28个活性化合物节点和210个靶点节点，共2 886条边。网络中菱形代表病毒性肺炎，三角形代表三叶汤中的药物，中间的长方形代表活性化合物，外周的圆形代表靶点基因。网络中的每条边代表药物所含有的活性化合物、活性化合物与靶点基因之间的相互作用关系。等级值及中心度值是衡量节点在网络中关键性的重要指标，故选取等级值与中心度值较大的节点，这些节点在网络中起到了重要枢纽作用，可能是关键化合物或靶点。分析所得排名前6位的活性化合物为MOL000098-槲皮素、MOL00682-表没食子儿茶素没食子酸酯、MOL000006-木樨草素、MOL000422-山奈酚、MOL000173-汉黄芩素、MOL004328-柚皮素，分别能与108、89、46、32、26、25个靶点蛋白发生作用。靶点方面，共有7个能与21个或21个以上的化合物相互作用，排名前6位的是CASP3、BCL2、PTGS2、BAX、RELA、JUN，分别能与28、26、24、23、23、23个活性化合物相互作用。

2.3 三叶汤治疗病毒性肺炎潜在作用靶点的预测通过GeneCards数据库检索共有3263个病毒性肺炎的潜在靶点。运用Omicshare云平台绘制Venn图，将三叶汤活性成分调控的靶点与病毒性肺炎的潜在靶点进行映射获取交集，共获得210个交叉靶点作为三叶汤治疗病毒性肺炎的潜在作用靶点，见图2。

图1 药物-有效成分-靶点网络图

2.4 PPI网络构建与分析PPI网络图中包含210个节点，340条边，见图3。靶点蛋白平均节点度值为3.24，其中度值大于4的靶蛋白有30个，说明三叶汤发挥药理作用的关键靶点极可能是这30个靶蛋白，见图4。从图中可看出各个蛋白互联关系网络中，排在前5位的分别是STAT3、JUN、AKT1、IL-6、VEGFA，提示这几个靶蛋白在三叶汤治疗病毒性肺炎中起到重要的作用。

表1 三叶汤中部分活性化合物的基本信息

图2 三叶汤治疗病毒性肺炎潜在靶点Venn图

图3 三叶汤“蛋白质-蛋白质”相互作用（PPI）网络图

2.5 靶点GO富集分析和KEGG通路分析将210个三叶汤治疗病毒性肺炎的潜在靶点基因输入到FunRich 3.1.3软件中，得到242个GO富集条目，见图5，包括23个BP、58个MF和161个CC。BP主要富集在信号传导、能量转换途径、蛋白代谢、细胞凋亡、细胞间通信、新陈代谢、核碱基监测、免疫应答、传输、细胞生长和（或）维持；MF主要富集在转录因子活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性、催化活性、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性、金属肽酶活性、细胞因子活性、细胞黏附分子活性、转换活性、氧化还原酶活性、受体信号复合体支架；CC主要富集在细胞质、细胞核、细胞质膜、细胞外基质、外泌体、细胞液、细胞外空隙、溶酶体、内质网、线粒体。KEGG通路富集分析筛选得到171条（P＜0.05）信号通路，主要涉及PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、人巨细胞感染通路（Human cytomegalovirus infection）、卡波西肉瘤疱疹病毒相关感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection）、糖尿病并发症的年龄信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、丙型肝炎（Hepatitis C）、乙型肝炎（Hepatitis B）等。选取前20条富集基因通路所绘制的气泡图，见图6，其中Y轴代表通路名称，X轴代表所占百分比，气泡面积代表通路富集基因数。根据蛋白靶点与信号通路之间的关系，选取关键通路，建立“靶点-通路”网络图，见图7。

图4 三叶汤治疗病毒性肺炎的关键靶蛋白信息

图5 GO富集功能分析图

图6 三叶汤治疗病毒性肺炎KEGG通路富集气泡图

图7 靶点-通路网络图

3 讨论

病毒性肺炎是由病毒感染引起的急性呼吸系统疾病。最常见的可引肺炎的呼吸道病毒有腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、鼻病毒、冠状病毒等［13］。病毒性肺炎属“疫病”范畴，其主要病机是人体正气和外感病邪之间的消长变化，就如“正气存内，邪不可干”的关系。人的正气受到先天禀赋与后天脏腑气血调养状态的影响，当人体正气的某一方有所偏颇，病邪性质和正气偏颇相切合时易发病［14］。岭南地区气候炎热，久居易阳热偏盛，热盛则汗泄而气阴不足；岭南常年湿气弥漫氤氲，湿热蕴结于内可致脾胃失健运，出现纳呆、腹胀、便秘，故岭南人常居此地则易致温病，以暑湿、湿热为主［15］。三叶汤中龙脷叶为岭南道地药材，其归肺、胃经，润肺止咳、通便，常用于肺燥咳嗽。此外在疏风清热的基础上兼顾湿邪的治疗。三叶汤由经典名方“止嗽散”加减组成，具有疏风清热、宣肺止咳之功效。文献报道通过三叶汤治疗肺型感染咳嗽且效果明显［16］。

本研究运用网络药理学方法共筛选出三叶汤中239个化合物，286个作用靶点，210个三叶汤治疗病毒性肺炎潜在靶点，表明三叶汤治疗病毒性肺炎的多成分、多靶点特征。从“药物-活性化合物-靶点”相互网络中筛查出关键活性化合物，根据中心度值和等级值排序得出前5名的有效成分为槲皮素、表没食子儿茶素没食子酸酯、山奈酚、木樨草素、汉黄芩素。提示槲皮素相互作用的靶点数共108个，说明槲皮素发挥的作用可能最为显著。槲皮素已被证实具有抗病毒、祛痰止咳、抗菌、免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等作用［17］。曹念等［18］认为表没食子儿茶素没食子酸酯可抑制炎症、脂质过氧化，清除氧自由基，从而减轻肺缺血再灌注损伤。没食子儿茶素没食子酸酯被证实可抗流感，主要是通过作用流感病毒血凝素，抑制RNA聚合酶，降低神经氨酸酶活性，具有多途径、多位点抗流感的良效［19］。木樨草素能促进IκB-α的表达，对急性肺损伤有保护作用［20］。研究表明，山奈酚可抗病毒、抗菌、抗炎、增强机体免疫、抗氧化［21］；汉黄芩素可显著抑制NF-κB信号通路，对急性肺损伤小鼠有保护作用［22］。

对三叶汤治疗病毒性肺炎PPI网络进行分析，共有210个靶点蛋白，网络拓扑分析发现，白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、STAT3、JUN、AKT1是三叶汤治疗病毒性肺炎的主要作用靶点。STAT3是一种能与DNA结合的蛋白质，在转录激活、信号转导方面发挥了关键性的作用。急性肺损伤时，JAKs-STAT3通路会被激活，而IL-6则能活化STAT3通路，从而保护肺；此外STAT3通路的激活，对抗凋亡有一定的作用［23］。JUN基因是禽肉瘤病毒17的转化基因，其编码的蛋白与病毒蛋白高度相似，能直接与特定的靶DNA序列作用，达到调节基因的作用。研究表明，JUN可参与肺损伤的修复过程［24］。AKT1是PI3K/Akt信号转导通路的关键分子，多种疾病如癌症、糖尿病常伴随Akt1调控的紊乱［25］。病毒感染、双链RNA可诱导正常细胞产生IL-6，参与免疫应答的细胞增殖分化，改善其功能。肺组织损伤时IL-6会参与到T细胞介导的免疫反应，参与肺部损伤、免疫损伤过程［26］。

从三叶汤治疗病毒性肺炎的靶点GO富集分析可看出，其生物过程主要涉及细胞间通信、细胞凋亡、新陈代谢、蛋白代谢、免疫应答等，这些生物过程在三叶汤治疗病毒性肺炎中起到了较为关键的作用。KEGG通路富集分析筛选得到171条信号通路，主要涉及PI3K-Akt、甲型流感病毒、人巨细胞感染通路、卡波西肉瘤疱疹病毒相关感染、EB病毒（epsteinBarr virus，EBV）、麻疹病毒、肿瘤坏死因子、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药等。研究证明，PI3K-Akt是病毒的一个重要靶标，该信号通路与细胞增殖、转录翻译、细胞凋亡等进程有着密切的联系，诸如埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒、EB病毒、流感病毒、人巨细胞病毒、柯萨奇病毒的感染，可通过阻断PI3K-Akt信号通路，达到抑制病毒之作用［27］。

本研究借助网络药理学的方法证实三叶汤治疗病毒性肺炎的多成分、多靶点、多途径的特点，可为三叶汤的拓展临床应用提供一定可靠的药物理论依据。但本研究仍有一定的局限性，如中药方剂的服用需要结合患者的临床症状进行具体辨证论治，由于数据库查询相关数据不全，可能会忽略中药成分含量、药物与成分间相互作用、体内其他药代动力学的影响等因素，其具体药理机制还需要得到更深入的科学研究和实验证明。