基于网络药理学探讨丹参治疗妊娠期高血压的作用机制*

曹焕泽，胡亦然，任玲，蔡平平

1.山东中医药大学，山东 济南 250000；2.山东第一医科大学附属省立医院，山东 济南 250000

妊娠期高血压（hypertensive disorders of pregnancy，HDP）是以高血压、蛋白尿为主要临床表现的妊娠期特发疾病，严重者伴发多脏器损伤，甚至导致死亡［1］。HDP是导致孕产妇和新生儿死亡的主要原因之一，死亡率占全球孕妇总死亡率的14%，与正常孕产妇相比，妊娠期高血压患者心、脑血管等远期并发症发生率有所增加［2-3］。近年来常在基础治疗的基础上联合中药注射液治疗妊娠期高血压的临床对照研究，选用的中药注射液以丹参制剂——丹参注射液与复方丹参注射液最为常见，并且有较好的治疗效果。丹参，是妇科常用药之一，有“女科要药”之称，其最早记载见于《神农本草经》，早在北宋时期已有丹参用于“妊娠中风”的记载。药理研究表明，丹参具有抗肿瘤、保护血管内皮、抗炎、抗氧化、抗抑郁、改善糖代谢等作用［4-5］。但是丹参活性成分多，作用靶点繁杂，其在妊娠期高血压治疗中的机制仍待进一步明确。

本文从网络药理学为角度，探讨丹参治疗妊娠期高血压的有效成分以潜在作用靶点，并探索其可能的作用机制，为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 丹参主要活性成分及潜在作用靶点筛选基于中药系统药理数据库和分析平台（TCMSP），以“丹参”（danshen）为关键词，生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18作为筛选条件检索，获得丹参主要活性成分及作用靶点。

1.2 妊娠期高血压的相关靶基因检索应用Genecards数据库（https：//www.genecards.org/）以“hypertensive disorders of pregnancy”为关键词检索，获取HDP的所有相关基因，保留Score≥10的结果。同时在OMIM数据库（https：//omim.org/）中，以“hypertensive disorders of pregnancy”为关键词检索，获取相关基因。将两数据库中获得的基因进行合并、去重以及规范基因名称等处理。

1.3 构建“疾病-药物-活性成分-靶点”网络图将丹参主要活性成分的靶基因与妊娠期高血压相关靶基因进行映射，利用韦恩图（Venn）将两者取交集，得到丹参-妊娠期高血压的药物-疾病交集基因。将交集基因及丹参主要活性成分定义为网络图的节点，药物、疾病、药物——疾病交集靶点基因以及药物活性成分间相互作用关系定义为网络图的连接，运用Cytoscape软件，构建丹参治疗HDP的“疾病-药物-活性成分-作用靶点”网络图。

1.4 药物-疾病靶点蛋白互作网络（PPI）的构建将药物-疾病交集靶点基因，作为“Ptotein Name”输入STRING数据库（https：//string-db.org/），物种设定为“Homo sapiens”，结合分数设定为＞0.4，忽略孤立节点，构建丹参-妊娠期高血压的靶点蛋白互作网络。

1.5 GO生物过程及KEGG信号通路分析采用Uniprot数据库，将药物-疾病交集基因名称转化Uniprot ID。运用Bioconductor数据工具平台（http：//www.bioconductor.org/）与Rx64（3.6.3）软件，分析靶点的GO富集和KEGG信号通路，并将所得结果可视化。

2 结果

2.1 丹参主要活性成分与相关分子靶基因通过TCMSP数据库搜索“丹参”，检索到202种化合物。以OB≥30%和DL≥0.18为条件进行筛选，得到丹参主要活性成分65种，对应靶基因108个。

2.2 妊娠期高血压相关基因以“hypertensive disorders of pregnancy”为关键词进行检索，于Genecards数据库获取HDP相关基因4706种，设定相关度≥10%为筛选条件，二次筛选后收集到基因1 573个；于OMIM数据库中检索到HDP相关基因735个。将两数据库获得的相关基因汇总、删除重复基因，共1 945个HPD相关基因，作为疾病靶基因。

2.3 “疾病-药物-活性成分-作用靶点”网络将丹参对应的108个靶点基因与1945个疾病靶基因进行映射，通过Venn图分析得到丹参-HDP相交靶基因共73个。将节点及节点间相互作用的数据导入到Cytoscape软件，得到丹参治疗HDP的“疾病-药物-活性成分-作用靶点”网络图，见图1，其中靶点基因中PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、ADRA1A、ACHE度值较高，丹参活性成分中度值较高的为luteolin、tanshinone iia、4-methylenemiltirone、salviolone、dihydrotanshinlactone。

图1 “疾病-药物-活性成分-作用靶点”网络图

2.4 药物-疾病靶点蛋白互作网络（PPI）将73个丹参-HDP交集基因导入STRING数据库进行蛋白相互作用网络分析，见图2，PPI网络中蛋白节点73个，764条相互作用线，平均节点度20.9，平均局部聚类系数为0.7。根据PPI中基因之间连接节点数目，统计出连接节点最多的30个核心靶点，见图3。其中AKT激酶（AKT1）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）为连接节点最多的4个靶点，连接节点数目分别为43、40、39、38个。

图2 药物-疾病靶点蛋白互作网络图

图3 药物-疾病核心靶点

2.5 GO富集功能分析GO富集分析获得109个生物过程，排名前10的分子功能（molecular function，MF）、生物过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC），见图4。MF以儿茶酚胺、磷酸酶、类固醇、细胞因子受体结合及G蛋白偶联胺受体、肾上腺素能受体、核受体、转录因子、类固醇激素受体活化为主；血管的大小、管径、收缩及循环系统中血管的调节，对类固醇激素、抗生素、异生物质、金属离子的应激反应、肌细胞增殖、腺体发育是主要BP。CC相关度高的为细胞膜、膜质微区、膜区域，突触前膜、突触后膜、突触膜的组成部分及固有成分等。

图4 GO富集功能分析

2.6 KEGG通路富集分析KEGG通路富集到44条相关通路，筛选出富集程度最高的20条通路，见图5。其中信号传导通路在相关通路中占据较大比重，涉及PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、FOxO信号转导通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路等。其中PI3K/AKT信号通路，见图6，涉及CHRM2、EGFR、AKT1、VEGFA、CCND1、CDKN1A、CASP9、MAPK1、IL6、MDM2、ERBB2、IL2、IL4、INSR、MET、BCL2、MYC、ITGB3等18个相关基因，基因富集程度最高。

图5 KEGG富集程度最高的20条通路

图6 PI3K/AKT信号通路

3 讨论

本文运用网络药理学的方法对丹参治疗妊娠期高血压的相关活性成分、作用靶点以及途径进行分析。丹参活性成分多，经过筛选后，生物利用度与类药性较高的丹参活性成分达65种，丹参酮、隐丹参酮、木犀草素、4-亚甲基硝胺以及二氢丹参内酯度值较高，可能在治疗妊娠期高血压中发挥更关键作用。

丹参治疗HDP潜在靶点的PPI网络分析显示，AKT激酶（AKT1）、IL-6、血管内皮生长因子A（VEGFA）、丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）等靶点相互作用蛋白众多，可能为关键靶点。AKT作为多种信号通路的中心节点，参与代谢，细胞增殖、存活、生长，血管生成的调节等过程的信号传导［6］。VEGF具有血管扩张的作用，可诱导一氧化氮的产生，通过调节血管活性功能和血管生成反应，参与胎盘发育和功能所需的新血管的形成［7］。胎盘受损的螺旋动脉重塑导致抗血管生成因子释放，诱发母体血管内系统性炎症反应和内皮功能障碍是导致妊娠期出现高血压和蛋白尿［8］。IL-6可与体内其他炎性因子相互作用，令血管收缩与血压升高，导致子痫等一系列的临床表现［9］。MAPK是丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路的重要组成部分，参与内皮细胞炎性反应和炎性因子表达信号通路的转导。PPI网络中显示了与血管及内皮生成、炎症反应相关的一系列靶点，如表皮生长因子受体PP1、NOS2、IL10、IL4、IL2、IFNG、CD40配体等；与细胞凋亡及离子通道调节相关的蛋白，如Bcl-2、E3泛素蛋白连接酶等。

靶点的富集分析显示丹参治疗HDP的作用涉及多个生物过程及信号通路，如PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、表皮生长因子受体、FOxO信号转导通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路等。胎盘螺旋小动脉重铸不足、胎盘持续缺氧是先兆子痫发病机制之一，低氧胎盘释放出抗血管生成和促炎因子，引起母体血管内皮功能障碍、高血压和器官损伤［10］。PI3K/AKT信号通路存在广泛，参与细胞生长、增殖及分化与迁移的调节，介导sFlt-1等血管内皮生长因子拮抗剂蛋白的激活，调节血管生成因子的血浆水平与血管介质，通过调节滋养层细胞的侵袭，维持胎盘功能；同时可激活下游eNOS，促进NO释放，调控血管舒张，增加胎盘血供［11-13］。曹慧敏等［14］发现，丹参酮II A通过调控PI3K/Akt信号通路减轻氧化应激导致的内皮细胞损伤。缺氧诱导因子信号通路（HIF-1信号通路）参与氧化应激反应，通过激活下游相关靶点减轻耗氧量，并调控Bac-2以调节细胞凋亡。缺氧诱导因子（HIF-1）是HIF-1信号通路中的关键因子，在机体处于低氧状态时激活HIF-1信号通路参与氧化应激反应，调节机体各组织功能，减轻耗氧量，适应缺氧状态［15］。HIF-1信号通路过度活化，胎盘对氧敏感性增加，滋养细胞的浸润能力下降，是导致妊娠期高血压的机制之一［16］。JAK/STAT信号通路可作用于细胞生长和分化及免疫等，与内皮细胞功能障碍相关，抑制此通路可改善血管内皮的分泌功能以及eNOS高表达，阻止子痫前期的重要危险因素sFlt-1的产生［17-18］。表皮生长因子通路（EGF信号通路）调节滋养细胞的分化，其破坏可能导致发生妊娠期高血压［19］。炎性过程与妊娠期高血压的发病相关，患有妊娠并发症的妇女血清中TNF-α，IL-6，IL-10等炎性因子升高［20-21］。TNF信号通路可调控IL-6与NF-κB表达，调节eNOS，控制血管炎症，同时可调节氧化应激反应，改善胎盘血管循环障碍［22-23］。FOXO是丝氨酸/苏氨酸激酶AKT（也称为蛋白激酶B）的主要底物，PI3K/Akt途径的激活拮抗FOXO活性，又能够扩增信号传导［24］。

综上所述，本文通过网络药理学的方法对丹参在治疗妊娠期高血压中潜在作用机制进行探究，认为丹参治疗妊娠期高血压的相关靶点多集中在AKAKT1、IL-6、VEGFA、MAPK1等靶点，调控PI3K/AKT信号通路、HIF-1信号通路、VEGF信号通路、TNF信号通路、表皮生长因子受体、FOxO信号转导通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路等多条通路，影响胎盘螺旋动脉收缩、保护血管内皮细胞、调节机体炎症反应与氧化应激。但是网络药理学仅是单纯从化学成分、作用靶点、信号通路方面进行的理论筛选，后续仍需更多实验数据进行支持以及验证。