HPLC法测定熟肉制品中山梨酸的不确定度评估

◎ 庞皓元

（广西壮族自治区食品药品检验所，广西 南宁 530021）

熟肉制品是指以新鲜禽畜肉为原料，经酱卤、腌制、熏烤、蒸煮和干制等一种或多种热加工方式熟化成可直接食用的肉类加工制品[1-2]，生活中常见的预包装食品椒盐鸡翅、黑椒鸭掌、麻辣小鱼仔、发酵肉制品类等都属于熟肉制品，深受广大消费者的喜爱。由于肉制品含有丰富的脂肪、蛋白质，在加工、储藏和销售过程中，都极易受微生物和环境因素的影响，导致产品腐败变质，失去食用价值，故添加防腐剂是有效延长肉制品产品保质期的有效方式[3-4]。《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》（GB 2760—2014）规定[5]，熟肉制品中可添加0.075 g·kg-1的山梨酸及其钾盐，以延长熟肉制品的货架期和保质期。山梨酸具有低毒性，安全性较好，能较好地发挥抑菌作用[4,6]。不确定度是表征合理的赋予被测量值的分散性，与测量结果相联系的参数[7]。由于测量结果的不确定度由多种原因引起，故不确定度分为A类不确定度和B类不确定度[7-9]。不确定度数值的大小反应了测量结果的准确性。评定不确定度能提高分析检测质量的需要，也是实现检测结果互不可缺少的内容[7-9]。本文通过《食品安全国家标准 食品中山梨酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 500.28—2016）第一法液相色谱法测定熟肉制品中山梨酸的不确定度，以期为实验室质量控制、能力验证等提供参考[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

熟肉制品，中国检验检疫科学院提供的能力验证样品；实验用水均为超纯水；甲醇（色谱纯），德国Merck公司；山梨酸标准物质（含量99.99%，相对扩展不确定度0.3%），德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；乙酸铵（色谱纯），德国Merck公司；乙酸锌、亚铁氰化钾（均为分析纯），国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Water 2695高效液相色谱仪（配2998PDA检测器），美国waters公司；S180H超声波发生器，德国Elma公司；3-30K离心机，德国Sigma公司；Vortexgenie涡旋混匀器，美国Scientific Industries公司；梅特勒XS205DU电子天平，瑞士梅特勒公司。

1.3 方法

采用《食品安全国家标准 食品中山梨酸、山梨酸和糖精钠的测定》（GB 5009.28—2016）第一法液相色谱法测定肉制品中山梨酸的含量。

1.3.1 标准溶液配制

（1）标准储备液。精密称取山梨酸标准物质25.01 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解，并稀释至刻度，作为标准储备液（浓度1.000 mg·mL-1）。

（2）标准中间液的配制。精密量取标准储备液5.00 mL，置于50 mL量瓶中，用水定容至刻度，浓度为100.0 μg·mL-1。

（3）标准曲线的配制。精密量取标准中间液0.00 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL和7.50 mL分别置于10 mL容量瓶中，用水定容，制成标准曲线L1～L7，浓度分别为1.00 μg·mL-1、2.50 μg·mL-1、5.00 μg·mL-1、10.00 μg·mL-1、25.00 μg·mL-1、50.00 μg·mL-1和75.00 μg·mL-1。

1.3.2 样品处理

精密称取样品粉末置于50 mL比色管中，加3倍蒸馏水搅拌15 min混匀，即为复原样品。于复原样品中加水25 mL，涡旋均匀，于50 ℃水浴超声20 min，冷却至室温后加2 mL（92 g·L-1）的亚铁氰化钾溶液，再加入2 mL（183 g·L-1）的乙酸锌溶液涡旋混匀，于8 000 r·min-1离心5 min，将水相转移至50 mL容量瓶中，于残渣中加水20 mL，涡旋混匀后超声5 min，于8 000 r·min-1离心5 min，将水相转移至同一50 mL容量瓶中，并用水定容至刻度，混匀。取上清液经0.22 μm滤膜过滤，滤液待上机分析，稀释倍数为50倍。

1.3.3 色谱条件

流动相：甲醇+20 mmol·L-1乙酸铵溶液（5+95)；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：230 nm；进样量：10 μL；色谱柱：ECHWAY太玮科技JADE-PAK®ODS-AQ色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

1.4 不确定度来源分析

1.4.1 不确定度模型

熟肉制品中山梨酸含量的计算公式如式（1）：

式中：X为熟肉制品中山梨酸的含量，mg·kg-1；C为样品中山梨酸的质量浓度，μg·mL-1；V为样品的定容体积，mL；m为样品质量，g。

1.4.2 不确定度来源

从测定过程和数学模型分析，熟肉制品中山梨酸测定的测量不确定度来源主要有以下几个方面：①标准物质纯度的不确定度U(标纯)。②标准物质称量引入的不确定度U(标称)。③标准曲线配制引入的不确定度U(标配)。④标准曲线拟合引入的不确定度U(标曲拟合)。⑤样品的质量引入的相对不确定度u(样称)。⑥样品定容体积的不确定度分量U（样品定容）。⑦样品测量重复性的不确定度分量U(样品重复)。⑧高效液相色谱仪测得峰面积的不确定度u（仪器）[11-12]。高效液相色谱法测定熟肉制品中山梨酸的不确定度来源见图1。

图1 高效液相色谱法测定熟肉制品中山梨酸的不确定度来源图

2 结果与分析

2.1 标准物质的相对不确定度U(标纯)

由标准物质证书中可知，标准含量值为99.99%，标准值的相对不确定度为±0.3%，

2.2 标准物质称量引入的相对不确定度U(标称)

标准物质的称量质量山梨酸为25.00 mg，用梅特勒XSE205DU电子天平（d=0.01 mg），电子天平称量样品，在称量程范围内，误差主要有以下两方面。

（1）天平示值的不确定度。使用的电子天平依据《电子天平计量检定规程》（JJG 1036—2008）检定合格[13]，本次使用梅特勒XSE205DU电子天平（d=0.01 mg），e=10×0.01=0.1 mg，最大允许误差的绝对值为MPEV=0.5e=0.5×0.1=0.05 mg，按均匀分布计算称量标准质量时由天平的最大允许误差引起的标准不确定度为：

（2）按单次测量计，则称量标准物质质量时由天平的最大允许误差引起的相对不确定度为：

2.3 标准曲线配制引入的相对不确定度U(标配)

由表1可知，标准曲线配制过程共使用了25 mL容量瓶（A级）1个，50 mL容量瓶（A级）1个，10 mL容量瓶（A级）7个，使用了3次5.0 mL移液器（分别移取5.00 mL 2次，2.50 mL 1次），1次10.00 mL移液器（移取7.50 mL），1次200 μL移液器（移取100 μL），1次1.00 mL移液器（移取0.25 mL 1次，0.50 mL1次，1.00 mL1次）。

由使用的器皿因定值引起的标准不确定度及定容溶剂因温差产生的体积膨胀引起的标准不确定度详见表1，可知U（标配）为0.059 48。其中，玻璃器皿和移液器体积定值准确性引入的不确定度以及定容溶剂因温差（实验室温度25 ℃）产生的体积膨胀带来不确定度均服从均匀分布，包含因子

2.4 标准曲线拟合引入的相对不确定度U(标曲拟合)

标准曲线拟合引入的不确定度，根据公式（2）（3）计算：

式中，SR-标准曲线的残差标准偏差；n1-样品溶液的测量次数；n2-标准曲线的测量次数；cj-样品浓度均值；c标j-第j次测量时标准溶液的浓度；-标准溶液理论浓度平均值；A标j-第j次测量标准溶液时所得峰面积；B0标-标准曲线截距；B1标-标准曲线斜率；U（标曲）标-标准曲线拟合引入的标准不确定度；U（标曲）-标准曲线拟合引入的相对不确定度。

标准曲线拟合引入的不确定度，由表2可知U（标曲拟合）为0.009 18。

表1 标准曲线配制引入的不确定度表

2.5 样品的质量引入的相对不确定度U(样称)

称取2.00 g 样品10份，结果如表2所示，平均值2.089 3 g。使用的梅特勒XS205DU电子天平（d=0.1 mg），检定分度值e=10d=1 mg，在本次测量使用的量程范围内，误差主要有以下3方面。

（1）天平示值的不确定度。使用的梅特勒XS205DU电子天平（d=0.1 mg），根据检定证书，当0≤m≤50 g时，天平示值误差为0.1 mg，按均匀分布，其标准不确定度为

（2）天平称量重复性的不确定度。根据检定证书，天平重复性误差0.2 mg，按均匀分布，其标准不确定度为：

（3）样品称量的标准不确定度：

样品称量的相对标准不确定度：

2.6 样品定容体积的不确定度分量U（样品定容）

定容的不确定度来源于容量瓶允差和温度效应两个方面。

表2 标准曲线拟合引入的不确定度表

（1）量瓶允差的不确定度。根据《常用玻璃量器检定规程》（JJG 196—2006），50 mLA级容量瓶的最大允许差为±0.05 mL，服从三角分布，则有：

（2）温度效应的不确定度。实验室温度（25 ℃）与容量瓶校正时的温度（20 ℃)不相同引起的体积不确定度，水体积膨胀系数为2.08×10-4mL·℃-1，在95%置信概率下，按矩形分布，属B类不确定度，因此产生的体积膨胀不确定度照均匀分布计算为；

则样品溶液定容体积的相对标准不确定度：

2.7 样品测量重复性的不确定度分量U(样品重复)

重复10次检测山梨酸含量，其测定结果如表3所示，10份试样平均含量为52.678 mg·kg-1，所引起的不确定度，主要考虑A类不确定度。根据JJF 1135—2005的公式（4）～（7）合并计算，公式如（4）所示：

式中：X-单个试样中山梨酸的含量，单位为mg·kg-1；Xi-试样中山梨酸的含量平均值，单位为mg·kg-1；n1-样品溶液的测量次数，本试验n1=10；n2-单个样品检测次数，本试验n2=2。

由式（4）求得U(样品重复)=0.004 992 75 mg·kg-1。

2.8 高效液相色谱仪测得峰面积的不确定度U（仪器）

由校准证书上可知，Waters 2695高效液相色谱仪的定量重复性为1.8%，按均匀分布计算，则液相色谱仪的标准不确定度为

2.9 相对合成标准不确定度评定

由于各参数之间相互独立，各不确定度分量详细情况见表4，故相对合成标准不确定度：

表3 10份平行试样峰面积及含量测定结果表

表4 不确定度一览表

2.10 扩展不确定度

选择95%置信概率，取包含因子k=2，测量结果不确定度：U=k×U（合成），取k=2，则U=k×U（合成）=2×3.260＝6.519 mg·kg-1。

2.11 结果表示

根据JJF 1135—2005标准规定，扩展不确定度的有效数字不超过2位，本次肉制品中山梨酸的测定平均结果为：52.678 mg·kg-1，测定结果表示为：X=（52.678±6.519）mg·kg-1，k=2。

3 结论

在高效液相色谱法测量熟肉制品中山梨酸含量的实验时，对熟肉制品重复测定10次，平均含量为52.678 mg·kg-1，其扩展不确定度为6.519 mg·kg-1。熟肉制品中山梨酸测定结果的不确定度主要来源于标准溶液配制引入的B类不确定度和仪器定量重复性引入的A类不确定度。在实际操作中，应尽量减小这两部分的影响，有效降低结果的扩展不确定度。