分散固相萃取-超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱测定樱桃中的苯丁锡和三苯锡的方法研究

◎ 陈佩佩，陈琳珊，何雯倩，陈 茹

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442;2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442;3.广东省质量监督食品检验站，广东 广州 511442）

苯丁锡和三苯锡是一类感温型抑制神经组织的有机锡杀螨剂，化学结构见图1，其特点为高效、毒性低、效果持续时间长，对防治果树、茶树、柑橘、葡萄和樱桃等作物虫害有显著效果，因此，近年来在农作物中应用广泛，同时在木材防腐方面也有较大的作用[1-2]。目前，对于苯丁锡和三苯锡的相关毒理性研究尚不充分，有研究表明，苯丁锡和三苯基锡具有一定的毒性，对牡蛎和其他贝类的生长有一定的影响[3]，而三苯基锡毒性比较大，低浓度就能引发生物体的内分泌紊乱[4]。因此，对消费者也产生了一定的潜在风险。美国、日本、欧盟等国家也制定了相关的限量标准。GB 2763—2019中明确规定，苯丁锡在柑橘中的限量为1 mg·kg-1，而在苹果、梨、葡萄等水果中，限量为5 mg·kg-1，樱桃、香蕉、草莓则是10 mg·kg-1，同时也增加了动物肉类的限量[5]。因此，建立高效快捷的测定方法具有重要的意义。

近年来，研究者对有机锡的测定方法进行了大量的研究。目前检测有机锡的方法主要有高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法[6-7]、气相色谱法[8]、气相色谱-串联质谱法[9-10]、高效液相色谱法[11-12]和高效液相色谱-串联质谱法[13]。高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法操作烦琐，所需试剂多，气相色谱及质谱法需对样品进行衍生，同样操作烦琐，且重复性差，液相色谱法则存在灵敏度低，目标物受杂质干扰严重等缺点。本文建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱法同时测定樱桃中的苯丁锡和三苯锡，前处理简单高效，且峰型好，灵敏度高，分析时间短，可进行日常实验室大批量的测定。

图1 苯丁锡和三苯锡的化学结构图

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

API4000Q质谱仪（美国AB SCIEX公司）；岛津LC-20AD液相色谱系统（日本岛津公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水系统（法国Merck Millipore公司）；4k-15离心机（北京卓明贸易有限公司）；IKA Vortex4涡旋混匀器（广州仪科实验室技术有限公司）。

1.2 试剂及耗材

樱桃样品购自广州市市场；苯丁锡和三苯锡（纯度≥98.5%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）；无水硫酸镁和氯化钠（分析纯，广州化学试剂厂）；甲酸、乙腈（HPLC级，美国Thermo Fisher公司）；C18、PSA、GCB、NH2粉和中性氧化铝（分析纯，上海安谱公司）；实验用水为经Milli-Q净化系统过滤的超纯水（电阻率为18.2 MΩ·cm-1）。

1.3 样品前处理

樱桃样品均质后称取2 g样品于50 mL离心管中，加入5 mL 水和10 mL乙腈，涡旋混匀后加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠粉末，涡旋提取10 min后，置于离心机中以10 000 r·min-1离心5 min-1，转移上清液1 mL至2 mL离心管中，加入30 mg C18粉末，涡旋2 min，10 000 r·min-1离心5 min，上清液过0.22 μm有机相滤膜上机。

1.4 标准溶液的配制

分别准确称取适量的苯丁锡和三苯锡标准品于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，再分别吸取一定量体积的标准溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容，折算后混合标准溶液浓度均为10 mg·L-1。

取阴性樱桃样品进行前处理，得到空白基质液，用所得基质液配制基质曲线，浓度分别为5.0 μg·L-1、10 μg·L-1、20 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1和500 μg·L-1。

1.5 色谱及质谱条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱：Xbridge BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流 动 相A（甲 醇）-B（0.3%甲 酸 含10 mmol·L-1甲酸铵）；流速：0.30 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温：40 ℃；梯度洗脱程序：0.0～2.0 min，40%→95%A；2.0～8.0 min，95%A；8.0～9.0 min，95%→40%A；9.0～13.0 min，40%A。

1.5.2 质谱条件

离子源：电喷雾电离源；扫描方式：正离子模式；气帘气：25 psi；电离电压（IS）：5 500 V；离子源温度（TEM）：550 ℃；雾化气（GAS1）：50 psi；加热辅助气（GAS2）：50 psi；碰撞气（CAD）：medium；采集模式：多反应监测（MRM）模式。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

实验尝试使用乙腈和甲醇作为有机相，0.3%甲酸溶液和0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸铵溶液作为水相进行了对比。结果发现，甲酸铵的加入对峰型影响较大，当水相中没有甲酸铵作为缓冲盐时，苯丁锡在流动相中扩散严重，峰型影响尤其明显，峰宽较宽，拖尾严重。而乙腈和甲醇相比，峰型影响不是很大，苯丁锡和三苯锡均能有较好的峰型，但考虑到乙腈洗脱能力较强，可能造成的基质效应相比甲醇更严重，所以综合考虑，选择甲醇-0.3%甲酸含10 mmol·L-1甲酸铵体系作为流动相。苯丁锡和三苯锡的MRM色谱图见图2。

图2 苯丁锡与三苯锡的MRM色谱图

2.2 质谱条件的确定

实验初期发现，苯丁锡和三苯锡的母离子均是由O-Sn键断裂，产生对应的脱电子正离子，同时因为Sn的同位素较多，所以得到的母离子也较多，最终选择响应较高的作为母离子。进一步采用流动注射方式，优化去簇电压DP，使母离子响应达到最优，确定DP后，进一步优化各碎片离子的碰撞电压CE，选择响应较高的两个离子对作为定性定量依据，响应最高的为定量离子，另外的为定性离子。详细的质谱参数见表1，质谱图见图3。

表1 多反应监测测定二级碎片的质谱参数表

图3 苯丁锡和三苯锡的二级质谱图

2.3 固相萃取剂种类的选择

为了降低基质效应对结果的影响，同时保证回收率，实验前期对固相萃取剂的种类对回收率的影响进行了探究，选取了C18、PSA、GCB、NH2和中性氧化铝作为固相萃取剂，使用量均为25 mg。结果显示，在两次平行实验中，C18和PSA的回收率最高，其次是NH2，对苯丁锡和三苯锡的吸附也相对较小。而GCB和中性氧化铝对苯丁锡和三苯锡吸附严重，导致回收率低。虽然C18和PSA吸附的杂质类型不同，但由于两者回收率均较高，且C18的回收率要略高于PSA，因此为了简化实验，最终选择只使用C18作为固相萃取剂。回收率结果见图4。

图4 固相萃取剂对回收率的影响图

2.4 基质效应的探讨

樱桃中含有大量的糖和色素，在提取过程中易被提取到乙腈层引起较大的基质效应，从而增强或抑制苯丁锡和三苯锡的离子化程度，因此，需要对基质效应进行研究和定量结果校正。实验分别用乙腈和空白基质液配制100 μg·L-1的单点混合标准溶液，按优化后的方法测定，以基质单点和溶剂单点的峰面积比值K为判断依据。当K值小于80%，则说明基质抑制效应明显，大于120%则说明基质增强效应明显。测定结果为苯丁锡38.5%，三苯锡39.8%，基质抑制效应较为严重，因此，最终使用基质曲线进行定量。

2.5 定量分析依据

用空白基质溶液配制线性范围为5.0～500 μg·L-1的基质曲线对苯丁锡和三苯锡进行定量。将基质曲线按前处理方法上机测定后，以浓度为横坐标（X）和定量离子对峰面积为纵坐标（Y）绘图，所得方程为苯丁锡：Y=38.86X+2 304，相关系数R2为0.999 1；三苯锡：Y=40.21X+2 553，相关系数R2为0.999 2。结果表明苯丁锡和三苯锡的基质曲线在5.0～500 μg·L-1的浓度范围内呈良好线性关系。同时以低浓度加标进行测定，按照信噪比RS/N=3和RS/N=10分别计算出方法检出限和方法定量限，苯丁锡和三苯锡的检出限均为25 μg·kg-1，定量限均为100 μg·kg-1，方法灵敏度达到分析测定要求，满足样品一般含量的测定。

2.6 回收试验及精密度

选用苯丁锡和三苯锡呈阴性的樱桃样品，进行加标回收实验。根据方法定量限的1、2、5倍进行标准添加，每个水平平行测定6次，并计算出相应的相对标准偏差RSD。结果得出，苯丁锡和三苯锡在樱桃中的平均回收率范围在80.7%～94.5%，RSD在1.26%～4.52%。表明方法回收率好，精密度高，能够准确定量樱桃中的苯丁锡和三苯锡含量，具体结果见表2。

表2 樱桃中苯丁锡和三苯锡的回收率和精密度（n=6）表

2.7 方法的实际应用测定

随机选取实验室日常样品30个，用建立的方法进行测定，测定结果为三苯锡均低于检出限，而有一个样品检出了苯丁锡，含量为1.51 mg·kg-1，高于定限量，但符合GB 2763—2019中樱桃样品苯丁锡的检出限量10 mg·kg-1规定。同时，说明目前市面上的樱桃存在一定的苯丁锡残留风险，需要加大监管力度。

3 结论

本研究以分散固相萃取为前处理基础，建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定樱桃中的苯丁锡和三苯锡。乙腈-水体系提取，过程快速高效，提取率高，结合C18固相萃取剂进行净化，回收率高；使用超高效液相色谱柱，梯度洗脱分离，在优化后的流动相和洗脱程序下，苯丁锡和三苯锡在9 min内出峰，且拖尾现象不严重，峰型较好；利用基质曲线对定量结果进行校正，加标回收实验结果表明，方法回收率好、重现性好，可用于实际测定樱桃中的苯丁锡和三苯锡。