基于UPLC-MS/MS探究烘焙程度对咖啡豆中有机酸含量影响

王东旭，王新财，胡奇杰，王凤丽，厉 芬，陈褚建

（湖州市食品药品检验研究院，浙江湖州 313000）

咖啡作为世界三大饮料之首，深受各国人民的喜爱[1]。酸度是评价咖啡饮品品质的重要因素之一，而咖啡中的酸度主要来自咖啡豆烘焙过程中产生的酸，烘焙咖啡豆中含有水溶性绿原酸、奎尼酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、醋酸、甲酸、乳酸、甘醇酸等三十多种有机酸以及无机磷酸[2]。研究表明有机酸具有软化血管、促进微量元素吸收、帮助胃液消化等功能[3]。有机酸的含量受烘焙的温度及时间影响较大，同时还受咖啡豆的种类影响[4]。与咖啡豆其他有效成分相比，酒石酸、苹果酸、柠檬酸等有机酸在咖啡豆中含量并不高，其总量约占2.5%[5]，目前对引起咖啡酸味的脂肪族酸含量的报道较少，现有报道主要侧重于对烘焙咖啡豆中有机酸检测方法的报道[2,4,6]，以及烘焙程度对咖啡豆中原有有机酸含量研究[7]。烘焙程度对多种有机酸尤其是新生成的有机酸含量影响还少有研究。有研究表明，苹果酸和柠檬酸会形成温和愉悦性的酸味[2]，高温下绿原酸降解产物奎尼酸会形成咖啡风味中的涩感[8]，奎尼酸降解产物莽草酸是多种芳香化合物的前体物质[9]，因此考察不同烘焙程度下咖啡豆中有机酸含量变化对于烘焙咖啡豆的口感控制极为重要。

目前，有机酸的检测方法主要有分光光度法[10]、气相色谱法[11-12]、高效液相色谱法[13-16]、离子色谱法[17-18]和液质联用法[19-21]等。分光光度计法检出限较高；气相色谱法需要衍生处理；高效液相色谱法可测定大多数有机酸，但紫外灵敏度相对较低；而液质联用法因具有高选择性和高灵敏度等优点而被广泛使用[20]。咖啡中的有机酸测定目前还是以液相色谱为主，尚未见到液质联用技术用于咖啡中有机酸检测的报道。

本研究以产自洪德拉斯咖啡豆为原料，经过不同程度（轻度、中轻度、中度、中深度、重度、重深度）的烘焙，采用新建立的超高效液质联用法检测7种有机酸（富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸、柠檬酸）含量。通过分析有机酸含量变化揭示不同烘焙程度对咖啡豆有机酸成分的影响，研究7种有机酸含量变化的相互关系和烘焙中新生成的有机酸含量变化规律，并对4种咖啡豆（分别产自肯尼亚、印尼、巴西、萨尔瓦多）进行验证，完成开发基于酸感的烘焙工艺。该研究为进一步深入认识咖啡酸感形成的机制奠定了基础，也对咖啡豆烘焙产品的开发有较强的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

洪德拉斯SHB咖啡豆 产自洪都拉斯NINFA LANZA庄园；肯尼亚AA++咖啡豆 产自肯尼亚奇雅瓦姆鲁鲁；印尼罗布斯塔咖啡豆 产自印度尼西亚爪哇；巴西喜拉多咖啡豆 产自巴西喜拉多；萨尔瓦多红波旁咖啡豆 产自萨尔瓦多Loma La GIoria庄园；琥珀酸（succinic acid，99.5%）、苹果酸（malic acid，98.0%）、酒石酸（tartaric acid，99.0%）、莽草酸（shikimic acid，98%）、奎尼酸（quinic acid，98.0%）、柠檬酸（citric acid，≥99.5%） 标准品，上海麦克林生化科技有限公司；富马酸（fumaric acid，99.5%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈（CAN，色谱纯）、甲醇（MeOH，色谱纯）德国Merck公司；甲酸（色谱纯） 上海麦克林生化科技有限公司；试验用水 为超纯水。

ACQUITYTM 超高效液相色谱、XevoTM TQD三重四极杆串联质谱仪 美国Waters公司；ME204E型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；Genius 3漩涡混合器 德国IKA公司；KQ-500DB型超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司；Allegra X-12R型台式冷冻离心机 美国Beckman Coulter公司；Simplicity型超纯水仪 美国Millipore公司；L9/11/B410型马弗炉 德国nabertherm公司；JFSD-100型粉碎机 上海嘉定粮油仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 混合对照品溶液的制备 分别称取富马酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸和柠檬酸标准物质适量，用水溶液配制成质量浓度均为1.00 mg/mL的单标储备溶液。再用纯水稀释成质量浓度为10.0 μg/mL的7种有机酸混合标准储备溶液。各对照品储备液和混合对照品储备液均置于4 ℃冰箱中保存。根据需要移取混合标准储备溶液，配制成浓度分别为50.0、100、500、1000和2000ng/mL的混合标准工作溶液。取1.00 mL标准溶液经0.22 μm水相滤膜后供高效液相串联质谱检测。

1.2.2 供试品溶液的制备 随机选取咖啡豆平铺一层于坩埚盘中，放入马弗炉固定位置烘焙。烘焙完成后，立即取出冷却至室温。设定烘焙温度为220 ℃，烘焙时间分别为10、20、30、40、50和60 min，对应的咖啡豆烘焙程度为轻度、中轻度、中度、中深度、重度、重深度。收集烘焙咖啡豆样品，用粉碎机将咖啡豆粉碎（粒径1.00 mm），供有机酸含量测定。

称取1.00 g（精确至0. 01 g）咖啡豆粉置于15 mL离心管中，加入10.00 mL纯水，涡旋2 min，超声20 min，以9000 r/min转速离心5 min。根据目标物含量再将上述溶液分别用纯水稀释10和500倍，过0.22 μm水相滤膜。按仪器工作条件进行测定。

1.2.3 测定方法 分别精密吸取上述混合对照储备液各5 μL，注入高效液相串联质谱仪，测定出峰面积，以浓度（ng/mL）（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制7种有机酸化合物标准曲线图。精密吸取上述供试品溶液5 μL，注入高效液相串联质谱仪，测定峰面积，采用外标法定量。

1.2.4 色谱及质谱条件 色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相A为乙腈溶液，流动相B为0.2%甲酸水（v/v，下同）溶液，梯度洗脱程序：0.0～2.0 min，3%A；2.0～2.5 min，3%～30%A；2.5～3.5 min，30%A；3.5～3.6 min，30%～3%A；3.6～7.0 min，3%A；流速0.35 mL/min；进样体积5 μL；柱温40 ℃。

质谱条件：电喷雾离子源（ESI）电离，负离子多反应监测（MRM）模式检测；毛细管电压为-2.5 kV；离子源和脱溶剂气温度分别为150 和350 ℃；脱溶剂气和锥孔气流速分别为800 和50 L/h；碰撞气为氩气；7种化合物的定性定量离子对（m/z）、锥孔电压及碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 待测物的监测离子对及最佳质谱参数Table 1 Selected transitions and optimized potentials of the target compounds

1.3 数据分析

采用Origin 9.0软件进行数据处理和图表的制作。

2 结果与分析

2.1 液相质谱条件的选择

文献[22]表明，因有机酸在反相色谱柱中的保留值较小，酸性物质在高极性流动相（水相比例高）中会存在电离形式和未电离形式，导致色谱图中同一物质出现多峰和拖尾现象，影响检测精度；控制流动相pH可以有效调控有机酸的测定形态，避免多峰和拖尾现象。因此，本研究考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液和乙腈-0.2%甲酸溶液等3种流动相对测定的影响。结果表明：7种有机酸类化合物中酒石酸和柠檬酸在乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸溶液条件下，出现明显拖尾现象，见图1；而在乙腈-0.2%甲酸溶液作为流动相下，7种有机酸类化合物半峰宽小，峰形对称尖锐，满足测试要求。

图1 液相色谱条件优化Fig.1 Optimization of UPLC conditions

2.2 标准曲线、线性范围和检出限

将有机酸混合对照溶液在上述液相质谱条件下进行测定，绘制进样浓度为横坐标、定量离子对峰面积为纵坐标的7种有机酸类化合物标准曲线，线性拟合得到线性方程和决定系数，结果见表2。由表2可知，7种有机酸线性拟合良好，决定系数均大于0.990。7种有机酸对照品溶液色谱图见图2。由图2可知，7种有机酸峰形良好，目标峰周围无杂峰干扰，满足定量检测要求。根据信噪比（S/N）=3，计算得到7种有机酸的检出限，结果见表2。

2.3 回收率和精密度实验

在烘焙洪都拉斯咖啡豆样品中分别加入3个浓度梯度的有机酸标准溶液，按上述条件平行测定6次，扣除本底含量后计算加标回收率和相对标准偏差（RSD），结果见表3。由表3可知，采用该研究建立的方法测定7种有机酸的加标回收率为81.9%～104.7%，RSD为0.53%～6.64%。7种有机酸化合物精密度和回收率均满足定量检验需求。

表2 回归方程和线性范围Table 2 Linearity parameters and linear ranges of BPs

2.4 烘焙程度及咖啡豆种类因素考察

对7种有机酸在不同烘焙程度下的含量变化进行研究，通过检测洪德拉斯SHB咖啡生豆在220 ℃温度下有机酸随时间变化的含量，得到7种有机酸的含量变化点线图，结果见图3。由图3可知，7种有机酸均有检出，其中最主要的酸是奎尼酸、柠檬酸和苹果酸，有机酸含量受温度因素影响较大。富马酸含量随烘焙时间的增加呈现先增加后降低的趋势，在烘焙40 min时达到最大值，含量为15.47 mg/kg；琥珀酸含量随烘焙时间的增加而增加，烘焙前30 min含量变化较小，烘焙40 min时开始快速增加，60 min烘焙含量最高；苹果酸含量随烘焙时间增加而逐渐降低，烘焙时间越长，苹果酸含量越低，烘焙40 min后降幅趋于平缓；酒石酸含量随烘焙时间增加而增加，烘焙60 min酒石酸含量最高，为8.93 mg/kg；莽草酸含量变化较为特殊，前30 min未检出，30 min之后开始检出，烘焙60 min达到峰值；奎尼酸含量随烘焙时间的增加而逐渐升高，20 min后变化幅度较小；柠檬酸含量随烘焙时间的增加呈现先增加后大幅减少的变化趋势。根据主要的三种酸柠檬酸、苹果酸与奎尼酸的含量变化表现可以看出轻度烘焙下，引起愉悦味道的柠檬酸和苹果酸总量最高，达到1201.5 mg/kg，引起涩味的奎尼酸含量最低，为1363.7 mg/kg，因此轻度烘焙时咖啡豆的酸感最佳。

图2 有机酸化混合标准溶液色谱图（50 ng/mL）Fig.2 Chromatograms for the mixed standard solution of organic acids（50 ng/mL）

表3 精密度与回收试验结果（n=6）Table 3 Results of tests for recovery and precision (n=6)

图3 洪德拉斯咖啡豆不同烘焙程度下的有机酸含量变化（n=3）Fig.3 Organic acid content of Honduras coffee beans with different roasting (n=3)

图4 4种咖啡豆不同烘焙程度下的有机酸含量变化（n=3）Fig.4 Organic acid content of 4 coffee beans with different roasting (n=3)

根据7种有机酸含量变化点线图结合文献报道[23-24]可以得到有机酸的相互关系和变化规律：苹果酸中α羟基受热易脱水转化为富马酸，造成苹果酸含量下降，富马酸含量上升；奎尼酸可以由绿原酸加热降解而来，莽草酸则由奎尼酸脱水生成，因此奎尼酸和莽草酸含量虽然都呈现上升趋势，但是莽草酸上升滞后于奎尼酸；柠檬酸在受热下则会分解成琥珀酸，造成柠檬酸与琥珀酸含量形成负相互关系；酒石酸则由葡萄糖氧化分解形成，造成含量上升。

基于洪都拉斯咖啡豆中有机酸变化规律和最佳酸度烘焙条件，本研究对市面上常见的其他产地咖啡豆进行了有机酸含量检测，验证上述规律及工艺。结果见图4，4种其他咖啡豆有机酸含量变化趋势与洪都拉斯咖啡豆相似，但含量有所差异。研究表明巴西喜拉多咖啡豆在中轻度烘焙酸度最高，印尼罗布斯塔咖啡豆则在烘焙过程中酸度最低。比较奎尼酸含量变化图发现，中轻度烘焙下，印尼罗布斯塔咖啡豆涩度最低；中深度到重深度烘焙过程中，印尼罗布斯塔咖啡豆涩度最高，但四种咖啡豆涩度差异较小。因此，本研究对烘焙过程中咖啡豆中有机酸变化规律具有普适性，满足咖啡豆的基于酸度口感的烘焙工艺要求。

3 结论

建立了以液质联用技术检测咖啡豆中7种有机酸化合物的检测方法；该方法采用纯水作为提取溶剂、采用UPLC-MS/MS在负离子多反应监测（MRM）模式下检测，外标法定量。该分析方法满足方法学考察要求，操作简便，灵敏度好，准确度高，实用性强，为咖啡豆中有机酸含量测定提供了技术支持。咖啡豆的口味受有机酸影响较大，有机酸含量与烘焙条件密切相关，烘焙程度中对咖啡豆中7种有机酸含量影响的研究报道还较少，通过测定在6种烘焙条件下咖啡豆中7种有机酸含量，结果显示7种有机酸均有检出，其中最主要的酸是柠檬酸，奎尼酸和苹果酸。烘焙过程中洪德拉斯咖啡豆，柠檬酸、苹果酸含量下降，琥珀酸、酒石酸、莽草酸、奎尼酸含量上升，富马酸含量先增加后降低；以柠檬酸和苹果酸为指标显示，在轻度烘焙条件下，酸度口感最佳；考察4种常见产地咖啡豆发现，不同咖啡豆有机酸变化趋势大体相同，但有机酸含量略有差异，因此调控烘焙程度及咖啡豆产地，可以有效地改变咖啡的酸味及涩味，同时本研究也为改进咖啡烘焙工艺提供了一定的理论依据。