电击死大鼠皮肤超微结构及心肌HIF-2α、H-FABP 的表达变化

2021-06-17冯国伟刘霞齐倩王松军杨琛腾左敏张国忠

法医学杂志 2021年2期

冯国伟，刘霞，齐倩，王松军，杨琛腾，左敏，张国忠

1.河北医科大学第一医院司法鉴定中心，河北石家庄 050031；2.河北医科大学法医学院河北省法医学重点实验室，河北石家庄050017

在法医学实践中，由电流引起的损伤或死亡较为多见，电流斑是判断电击损伤的主要形态学依据，然而在低电压、环境潮湿、水中触电等情况下则有可能不形成电流斑[1]，此类案件一般是结合案情、现场和尸体检验等综合作出判断，法医学检验尚缺乏形态学依据，因此，电击死尤其是无明显电流斑电击死的判定以及生前与死后电击的鉴别诊断仍然是法医学实践中亟待解决的问题[2-3]。本研究在大鼠电击模型的基础上，利用扫描电镜观察大鼠电击部位皮肤的改变，同时对心肌缺氧诱导因子-2α（hypoxia-inducible factor-2α，HIF-2α）和心脏型脂肪酸结合蛋白（heart typefatty acid-binding protein，H-FABP）含量进行检测，以期为电击死的法医学判定提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及模型建立

健康SD 大鼠72 只（由河北医科大学动物实验中心提供），雌雄不限，体质量（220±10）g，适应性饲养1 周，随机分为电击死组、死后电击组和对照组，每组24 只。

参照文献[4]，电击死组大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后连接自制电击装置，用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢，接通电源（220 V，50 Hz）电击至死。通电后大鼠开始痉挛、卷曲、尾强直，几秒钟即出现震颤，约2 min 后该现象减弱并消失。断电时，大鼠心搏呼吸停止，已死亡。将大鼠分别于死后即刻、死后30 min、死后60 min 取电击部位皮肤和心脏，每个亚组8 只。

死后电击组大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后颈椎脱臼处死，之后分别于死后即刻、死后30 min、死后60 min 连接自制电击装置，用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢，通电2 min（220 V，50 Hz），电击后立即取电击部位皮肤和心脏，每个亚组8 只。

对照组大鼠经10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉后，用金属夹连接大鼠左前肢与右后肢2 min，不通电，颈椎脱臼处死之后，分别于死后即刻、死后30 min、死后60 min 取连接装置部位皮肤和心脏，每个亚组8 只。

皮肤样本大小为3 mm×3 mm，部分置于4%甲醛溶液中待HE 染色，部分置于2.5%戊二醛固定液中，待扫描电镜观察。心脏组织置于4%甲醛溶液中待行免疫组织化学染色。

本研究通过河北医科大学动物伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器

兔来源抗HIF-2α 抗体（北京博奥森生物技术有限公司），兔来源抗H-FABP 抗体（武汉博士德生物工程有限公司），SP-9001 试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），DAB 显色试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］。

BX61 光学显微镜（日本Olympus 公司），S-3500N扫描电镜（日本Hitachi 公司）。

1.3 方法

1.3.1 HE染色

将大鼠皮肤组织固定制成蜡块，常规HE 染色后，置于光学显微镜下（×400）观察。

1.3.2 扫描电镜观察

皮肤组织经磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）清洗后乙醇梯度脱水（50%乙醇溶液20 min，70%乙醇溶液20 min，80%乙醇溶液20 min，90%乙醇溶液20 min，100%乙醇20 min），将皮肤组织置于扫描电镜下（×800）观察。

1.3.3 免疫组织化学染色

将大鼠心脏组织固定制成蜡块，切片常规脱蜡，PBS洗涤后，用3%过氧化氢（H2O2）室温下封闭30 min，浸于抗原修复液中微波抗原修复，自然冷却后用PBS清洗3 次，3%甲醇-过氧化氢室温孵育30 min，PBS 清洗3 次，滴加山羊血清工作液于37 ℃下封闭30 min；分别滴加1∶400 稀释的抗HIF-2α 抗体、1∶600 稀释的抗H-FABP 抗体，置于4 ℃湿盒中过夜，次日切片恢复室温后用PBS 清洗，滴加山羊血清工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗后再滴加生物素标记山羊抗兔IgG 聚合物，37 ℃孵育30 min，PBS 清洗，用DAB 显色试剂盒显色，苏木精复染，水洗返蓝，常规脱水透明后中性树胶封片，置于显微镜下观察。

HIF-2α 蛋白在心肌细胞内的表达为细胞核黄染，H-FABP 在心肌细胞内的表达为细胞质着色。各亚组切片于光学显微镜下随机选取10 个视野，运用Image-Pro Plus（IPP）图像分析软件计算HIF-2α 阳性细胞平均光密度值及H-FABP 缺染面积。

1.4 统计学分析

应用SPSS 16.0 软件（美国IBM 公司）进行统计分析。数据用表示，各组间的比较采用单因素方差分析，采用最小显著性差异（least significant difference，LSD）法进行两两比较，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 皮肤改变及HE染色

对照组皮肤无明显变化。电击死组与死后电击组大鼠电击处皮肤有烧灼表现；电流斑与接触导体走行一致，呈灰黄色，质地较硬，干燥，中央凹陷，周围稍隆起，边缘钝圆，与周围组织分界清晰。镜下见对照组表皮细胞排列整齐，无异常，细胞和胞核无极性化改变；电击死组与死后电击组可见表皮细胞融合变薄、致密，细胞界限不清，表皮细胞胞质均质化，表皮下空泡形成，纵向伸长且严重扭曲变形，有核流征表现。详见图1。

图1 各组大鼠皮肤的组织病理学改变（HE×400）Fig.1 Histopathological changes of rats skin in each group（HE×400）

2.2 扫描电镜观察

对照组皮肤在扫描电镜下可见复层扁平上皮排列整齐，细胞界限清晰。电击死组皮肤在扫描电镜下可见细胞碎屑，细胞界限不清，皮肤表面缺损，可见分枝型裂隙和枯焦状龟裂，皮肤表面散在圆形和椭圆形小孔，边缘不规则，散在大量球形异物颗粒，表面凹凸不平，附着或镶嵌于受损皮肤表面，在损伤区内不能区分角质层与其他各层细胞。死后电击组皮肤在扫描电镜下的改变与电击死组类似。详见图2。

图2 各组大鼠皮肤在扫描电镜下的观察结果（×800）Fig.2 Scanning electron microscope images of rats skin in each group（×800）

2.3 HIF-2α免疫组织化学染色

对照组大鼠心肌细胞偶见少量阳性表达，且各亚组之间比较差异无统计学意义。

与相应时间点对照组比，电击死各亚组HIF-2α表达均明显增多且在死后即刻达到高峰，差异具有统计学意义（P＜0.05）。电击死后30 min 组与电击死后即刻组比较差异无统计学意义，电击死后60 min 组与前两组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。

死后电击组仅在死后即刻较相应时间点对照组表达增多（P＜0.05），但低于电击死后即刻组（P＜0.05）；死后30 min 电击组和死后60 min 电击组心肌细胞均可见少量阳性细胞表达，但与相应时间点对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。死后30 min 电击组与死后60 min 电击组比较差异无统计学意义，但两组与死后即刻电击组比较差异均具有统计学意义（P＜0.05）。结果详见表1、图3。

图3 各组大鼠心肌HIF-2α免疫组织化学染色结果（×400）Fig.3 Immunohistochemical staining results of HIF-2α of rats myocardium in each group（×400）

表1 各组大鼠心肌HIF-2α蛋白表达的平均光密度值Tab.1 Immunohistochemical changes of HIF-2α of rats myocardium in each group （n=8，）

注：1）与相应时间点对照组比较，P＜0.05；2）与同组死后即刻大鼠比较，P＜0.05；3）与同组死后30 min 大鼠比较，P＜0.05；4）与相应时间点电击死组比较，P＜0.05。

2.4 H-FABP免疫组织化学染色

对照组大鼠心肌细胞可见较均匀一致的阳性表达，偶见点片状缺染，各亚组之间比较差异无统计学意义。

电击死组大鼠随死后时间的延长，心肌细胞缺染面积逐渐增大，各亚组之间比较差异均具有统计学意义（P＜0.05），与对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

死后电击各亚组心肌缺染面积较对照组增大，各亚组之间比较差异无统计学意义，但缺染面积低于相应时间点电击死组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。结果详见表2、图4。

图4 各组大鼠心肌H-FABP免疫组织化学染色结果（×400）Fig.4 Immunohistochemical staining results of H-FABP of rats myocardium in each group（×400）

表2 各组大鼠心肌H-FABP表达的缺染面积Tab.2 Staining loss area of H-FABP of rats myocardium in each group （n=8，，μm2）

3 讨论

电流损伤的形态学变化分为体表变化和体内变化两部分。本研究扫描电镜结果显示，对照组皮肤可见复层扁平上皮排列整齐，细胞界限清晰。电击死组皮肤可见细胞碎屑，细胞界限不清，皮肤表面缺损，可见分枝型裂隙和枯焦状龟裂，皮肤表面散在圆形和椭圆形小孔，边缘不规则，散在大量球形异物颗粒，表面凹凸不平，附着或镶嵌于受损皮肤表面，在损伤区内不能区分角质层与其他各层细胞。死后电击组皮肤镜下表现与电击死组类似。因此，单纯依据皮肤扫描电镜结果并不能有效区分电击死与死后电击。

HIF-2α 是HIF-2 的活性亚基和功能性亚基，受氧含量水平的调节，是细胞在缺氧应答反应中最早作出反应的调节因子，也是重要的调节因子之一[5-6]。TALKS 等[7]研究发现，除了巨噬细胞外，正常人的其他组织和器官中几乎没有HIF-2α 的表达。有关胚胎发育的研究[8-10]结果表明，HIF-2α mRNA 主要存在于血管内皮细胞，在肝细胞、肾成纤维细胞、胰腺间质细胞、心肌细胞和心肌间质细胞中也有一定的表达。在常氧状态下，HIF-2α 的半衰期很短，在细胞中处于不断被合成和降解的状态，在氧浓度低于2%的条件下，HIF-2α 亚基氧依赖性降解结构域（oxygen-dependent degradation domain，ODDD）中的脯氨酸残基Pro530和Pro405 不能被羟化，导致HIF-2α 不能被E3 泛素连接酶复合体的VHL 蛋白识别和降解，导致HIF-2α 蛋白在细胞核聚集增多[11]。本研究对照组大鼠心肌偶见少量阳性表达，说明HIF-2α 在正常心肌细胞中仅有少量表达，且在死亡后60 min 内表达无明显变化。而电击死组在死后即刻和死后30 min 出现HIF-2α 高表达，死后60 min 表达有所下降，推测心肌缺血缺氧在电损伤发生机制中的作用非常关键，电击死可能影响心肌的电子传递链从而导致细胞内窒息进而诱导HIF-2α 的高表达，且HIF-2α 对生前电击具有高度敏感性，在心肌缺氧60 min 后仅发生少量的降解，说明HIF-2α 具有较强的稳定性。死后电击组大鼠心肌仅在死后即刻出现一定的阳性表达，可能因为大鼠被处死后心肌细胞还存在一定的生物活性，导致心脏遭受电击后引起HIF-2α 高表达进而对心脏起保护作用，然而随着死后时间的延长，心肌细胞失活，抗原表位丢失等原因造成HIF-2α 低表达。

H-FABP 是心脏中富含的一种新型低分子量蛋白质，广泛存在于心肌细胞的胞质，分子量为14 000～15 000，占心脏中全部可溶性蛋白的4%～8%[12]。HFABP 是一种稳定的蛋白质，在细胞内转换半衰期为2～3 d，作为一种公认的心肌损伤标志物，H-FABP 对防止心肌损伤具有决定性的意义[13]。H-FABP 通过离子通道的调节结合或者释放脂肪酸，参与心肌内长链脂肪酸的代谢。H-FABP 具有高度心脏特异性[14]，作为一种心肌损伤的标志物得到越来越多的应用，目前主要用于急性心肌梗死的早期诊断、心肌早期损伤和缺血再灌注的评估等[14-16]。既往研究[17-18]结果证实，心肌缺血后心脏样本中可见H-FABP 缺失，并且缺失规律和肌红蛋白类似。本研究结果显示，对照组大鼠心肌细胞中H-FABP 大量存在，无明显缺染；电击死组大鼠心肌细胞中H-FABP 可见明显缺染，说明心肌细胞对缺血高度敏感，电击后心肌脂肪酸代谢加快以提供能量，心肌细胞内H-FABP 含量迅速上升，由于H-FABP 具有相对较低的分子量，且电击后心肌细胞受损，细胞膜通透性增加，H-FABP 从心肌释放，进入血液循环，随着死后时间的延长，H-FABP 持续进入血液导致H-FABP 缺染面积逐渐增大；死后电击组大鼠由于死后心肌失活，血液循环消失，仅有少量H-FABP 由心肌细胞释放进入血液，故死后电击各亚组均只有少量H-FABP 缺染。因此，进一步检测血液中H-FABP 的表达情况可为电击死的诊断提供依据。

综上所述，皮肤扫描电镜可为电击死的鉴定提供一定的帮助，但是并不能有效地鉴别生前电击与死后电击。死后电击各亚组心肌HIF-2α 表达均低于相应时间点电击死组，且在死后30 min 表达差异最大，而死后电击各亚组心肌H-FABP 表达均高于相应时间点电击死组，且在死后60 min 表达差异最大，提示HIF-2α、H-FABP 对电击死与死后电击的鉴别具有一定意义。