猪丁型冠状病毒的分离鉴定

陈奕帆，邱文英，张丽燕，孙继海，郝伟伟，严应海

（1.华派生物工程集团有限公司，四川 成都 641402；2.简阳市十里坝街道办事处社区事务服务中心，四川 简阳 641400）

PDCoV（猪丁型冠状病毒）属于套式病毒目、冠状病毒科、δ冠状病毒属，是近年来发现的一种新型猪肠道病病原。PDCoV是有囊膜的单股正链RNA病毒，基因组长约25.4 kb，其构成和排列顺序为5'UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-N-3'UTR[1-2]。其中，S基因编码的S蛋白含有1 159或1 160个氨基酸残基，以三聚体形式聚集于病毒囊膜的表面，主要参与病毒与宿主细胞的吸附和融合，同时也是诱导机体产生中和抗体的主要抗原蛋白[3-4]。最早于2012年由Woo等从中国香港收集的猪粪便拭子中检测到，随后国内研究学者贺东生等从严重腹泻的新生仔猪小肠病料中检测到PDCoV，且有证据显示2004年前国内不同地区的猪群中已存在PDCoV[2，5-6]。PDCoV可感染各种年龄段的猪群，但对新生仔猪的危害最大，感染率最高，引起的死亡率约为30%～40%[7]。感染仔猪临床表现为水样腹泻、呕吐、脱水，剖检病理结果显示肠壁变薄，变透明，肠内充斥着大量黄色液体，组织病理学变化主要见于空肠中、远端和回肠，十二指肠和空肠近端的病变不明显，病变主要表现为肠绒毛上皮细胞萎缩、坏死，同时退化的肠上皮细胞进入管腔[8]。PDCoV导致的临床症状和病理学变化与猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea,PED）或猪传染性胃肠炎（Transmissible Gastroenteritis,TGE）相似，且常伴随混合感染的情况，对于PDCoV的鉴别诊断需要借助实验室手段。

本研究利用特异性的RT-PCR方法对收集的6份病料进行检测，对确认为PDCoV 阳性的病料进行病毒的分离，并通过CPE、RT-PCR及S基因序列测定分析对分离的病毒进行鉴定，旨在为进一步开展PDCoV生物学特性研究和疫苗研制奠定基础。

1 材料

1.1 病料及细胞

华派生物工程集团有限公司2016年从四川某猪场采集到6份腹泻仔猪小肠及内容物样本。猪睾丸（ST）细胞由华派生物工程集团有限公司保管及供应。

1.2 主要试剂

TRIzol™LS Reagent购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司；高效率逆转录试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；MEM培养基购自GIBCO；新生牛血清购自内蒙古金源康生物工程材料有限公司；PEDV、TGEV、PRoV（轮状病毒）和PDCoV的特异性引物由华派生物工程研发中心实验室保存。

2 方法

2.1 病料的检测

2.1.1 临床病料处理 取少量小肠组织及内容物置于1.5 mL离心管，加入适量的PBS，经组织匀浆机匀浆处理制成20%（1∶5的重量体积比）组织悬液，反复冻融3次，离心收集上清液。

2.1.2 病料的RT-PCR检测 参照TRIzol™LS Reagent试剂说明书提取病毒的基因组RNA，以提取的总RNA为模板，利用cDNA反转录试剂盒合成病毒cDNA。以cDNA为模板，配制PCR扩增体系：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 3 μL，ddH2O 7.5 μL。反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，45 s；55 ℃，30 s；72 ℃，1 min；30个循环；72 ℃，10 min。反应结束后，对PCR产物进行核酸电泳分析。

2.2 PDCoV-SCMS株的分离与鉴定

2.2.1 PDCoV阳性病料处理 取RT-PCR鉴定为PDCoV 阳性的小肠组织及内容物，加入灭菌的PBS研磨，制成20%（1∶5的重量体积比）组织悬液，反复冻融3次后离心收集上清液，上清液用0.22 μm滤器过滤除菌。

2.2.2 PDCoV病毒的分离与传代培养 取长成单层的ST细胞，倒掉细胞生长培养液，用PBS洗涤，加入过滤的上清液1.0 mL，置37 ℃吸附作用1 h后弃掉多余液体，加入含5 μg/mL胰酶的MEM维持液，置37 ℃、5% CO2培养箱培养。之后逐日观察细胞是否出现病变，无病变则在培养120 h后收获，继续进行盲传，直到出现明显的细胞病变，产生明显病变的细胞收获物在ST细胞上连续传代，当细胞病变稳定后进行病毒蚀斑纯化。重复进行两次蚀斑纯化，保存病毒种子并记为F1代，在ST细胞中继续传代培养。

2.2.3 分离毒株的RT-PCR鉴定 根据2.1.2中操作方法，对蚀斑纯化株F4代进行RT-PCR检测。

2.3 分离毒株的滴度测定

将分离毒株F5、F10、F15和F20代病毒液用含5 μg/mL胰酶的MEM维持液进行10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-74个稀释度病毒液，接种于长满单层ST细胞的96孔细胞培养板中，每个滴度接种8孔，每孔接种100 μL，同时设正常细胞对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养72～96 h，观察细胞病变。

2.4 分离毒株的S基因序列测定

参考GenBank上收录的猪丁型冠状病毒基因序列（登录号：MH715491.1），利用软件针对S基因保守区域设计4对特异性引物。引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列

参照TRIzol™LS Reagent试剂说明书提取F2代病毒的RNA，并利用cDNA反转录试剂盒合成病毒cDNA。以cDNA为模板，配制PCR扩增体系：2×PrimeSTAR®Max DNA Polymerase 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序为95 ℃，5 min；95 ℃，45 s；58 ℃，30 s；72 ℃，1.5 min；30个循环；72 ℃，10 min。反应结束后，将PCR产物送生物公司进行序列测定。

2.5 分离毒株的S基因序列分析

运用 DNA Star 软件中的 SeqMan 对扩增的 4个基因片段测序结果进行剪切拼接，获得 SCMS株的S基因序列，再利用MegAlign将SCMS株的S基因序列与 GenBank 收录的PDCoV参考毒株（表2）S基因序列进行比对分析。

表2 参考毒株信息

3 结果

3.1 病料的检测结果

利用实验室已有的 PEDV、TGEV、PRoV、PDCoV 特异性引物对2016年四川某猪场腹泻仔猪病料进行 RT-PCR 检测，检出6号病料为单一感染PDCoV的阳性病料（图1）。

图1 6号病料RT-PCR扩增结果

3.2 病毒的分离鉴定结果

3.2.1 病毒的分离 将处理后的6号病料上清液接种ST细胞，在盲传至第5代时出现明显细胞病变，在传至第8代后出现了较规律稳定的细胞病变，主要表现为细胞变大、变圆，继而细胞融合、脱落。第10代病毒接种ST细胞后60 h开始出现蚀斑，随时间增加蚀斑开始逐步变大，挑取直径为1.0～2.0 mm、清亮的蚀斑，经2次纯化，所有蚀斑直径大小基本一致。

3.2.2 分离毒株的RT-PCR鉴定结果 将蚀斑纯化株F5代细胞毒进行RT-PCR鉴定，扩增出一条约865 bp的特异性目的条带（图2），表明试验成功从6号病料中分离到一株PDCoV，命名为PDCoVSCMS。

图2 RT-PCR鉴定结果

3.2.3 TCID50的测定 分离株PDCoV-SCMS在ST细胞上连续传代，测定F5、F10、F15及F20代细胞毒的TCID50，培养72 h，观察细胞病变情况。按Reed-Muench法计算TCID50，具体结果见表3。PDCoV-SCMS在ST细胞上连续传代，病毒滴度较稳定。

表3 TCID50测定结果

3.3 S基因序列同源性分析

分离株PDCoV-SCMS的S基因包含3 480个核苷酸，与23个参考毒株之间的同源性为95.9%～98.5%，详见图3。PDCoV-SCMS分离株的S基因与美国、韩国、墨西哥分离毒株的同源性为96.8%～97.8%；与中国其他分离毒株的核苷酸同源性为97.1%～98.5%，其中与2018年山东分离株SD-11-2018同源性最高为98.5%；而与越南、泰国分离毒株的同源性最低，为95.9%～96.7%。

图3 SCMS分离毒株与参考毒株S基因序列同源性比对

4 讨论

自2012年Woo等首次从香港猪群中检测到PDCoV以后，在美国、加拿大、墨西哥、韩国、泰国、越南等国家相继出现了猪群感染PDCoV的报道[9-12]。2014年，在美国俄亥俄州PDCoV造成30%～40%仔猪死亡[13]。2015年，PDCoV在泰国某商品化猪场造成了母猪27.63%（829/3 000）的死亡率和仔猪64.27%（2 892/4 500）的死亡率[11]。同年7月，我国华南某规模化猪场5～15日龄仔猪发生大规模严重腹泻，发病率90%，造成的死淘率在90%以上，后经RT-PCR鉴定均为PDCoV阳性[5]。PDCoV在世界各地的相继暴发，给养猪业造成了巨大的经济损失。通过一些流行病学调查发现，PDCoV在我国大陆的流行已较为普遍，且我国近年来感染率呈上升趋势[15-17]。

猪肾小管上皮细胞（LLC-PK）、猪肾细胞（PK-15）及ST细胞是常用于PDCoV分离的细胞系，因此本试验利用ST细胞分离PDCoV。试验结果显示，从四川某猪场PDCoV阳性病料中成功分离到一株PDCoV，将该病毒株命名为PDCoV-SCMS株。PDCoV-SCMS毒株能在ST细胞上稳定增殖，形成典型的细胞病变，病毒滴度也较稳定，S基因序列同源性分析显示PDCoV-SCMS株与山东分离株SD-11-2018同源性最高为98.5%，与越南、泰国分离毒株的同源性最低。