一株猪A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

李天芝，于新友

（山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）

多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是巴氏杆菌科巴氏杆菌属细菌，可感染猪、牛、羊、兔、鸡等多种动物和人，是一种重要的人兽共患病原菌[1]。Pm可在健康动物上呼吸道定植，是一种条件性致病菌，分为A、B、D、E和F等5个血清型[2]。目前报道除E型外，其余血清型均可感染猪后引起猪巴氏杆菌病（即猪肺疫）[3]。猪巴氏杆菌病临床表现主要为败血症、肺炎、萎缩性鼻炎等，该病广泛存在于世界各地，随着我国禁抗时代的来临，该病呈高发态势，给养猪业造成了巨大的经济损失[4]。

2020年11月东营某猪场猪精神沉郁，采食量减少，体温升高，口鼻有白色泡沫流出，个别猪只呈犬坐姿势，呼吸极度困难，严重者死亡，剖检可见死猪气管内充满泡沫，肺出血、间质增宽、水肿。本试验无菌采集病死猪肝脏、肺脏等样品，进行细菌分离、形态学观察、生化试验、药敏试验、致病性试验及PCR鉴定，现报告如下。

1 材料

1.1 病料

对东营某猪场疑似巴氏杆菌病死猪剖检，无菌采取肝脏、肺脏等。

1.2 试验动物

10只16～20 g昆明小白鼠购自山东省实验动物中心。

1.3 试剂

普通琼脂平板、含5%血清的TSA琼脂平板、TSB液体培养基、革兰氏染色液如草酸铵结晶紫、革兰氏碘液、石炭酸复红染液等均由山东绿都生物科技有限公司质量监察部提供；糖发酵管及生化反应试剂和药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司；PCR反应试剂Taq酶、10×PCR Buffer、DL 2 000 DNA Marker、琼脂糖DNA凝胶纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等购自百泰克生物科技有限公司；pMD18-T载体购自大连宝生物公司。

1.4 PCR引物设计

参照文献[5]设计巴氏杆菌PCR鉴定和分型引物，鉴定引物为巴氏杆菌通用引物，扩增基因片段大小为457 bp，分型引物用于扩增A、B、D、E、F等不同巴氏杆菌血清型，扩增目的基因片段长度分别为1 048 bp、758 bp、647 bp、512 bp和852 bp。引物由通用生物系统（安徽）有限公司合成。

2 方法

2.1 直接涂片镜检

无菌采取病死猪肝脏、肺脏，玻片直接触片，干燥，固定后，革兰氏染色，显微镜镜检观察。

2.2 细菌分离培养

将采集的猪心血、肝脏、脾脏无菌划线接种于血液琼脂平板，37 ℃培养24 h，观察生长情况，对可疑菌落进行涂片，革兰氏染色镜检[5]。挑取单个可疑菌落接种于麦康凯营养琼脂培养基上，37 ℃培养24 h。

2.3 生化鉴定

分离菌经含5%血清的TSA琼脂平板纯培养24 h后，进行糖发酵试验及其他生化试验。

2.4 药敏试验

药敏试验采用纸片琼脂扩散法，将分离菌纯化后，接种TSB液体培养基进行纯培养，进行适当稀释后，无菌棉签均匀涂布在TSA培养基上，用镊子夹取药敏纸片放置在平板上，保持纸片间适度距离，每个平板上最好不超过6张药敏纸片。将平板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，观察结果，测量并记录抑菌圈直径。

2.5 致病性试验

10只昆明小鼠，随机分为两组，试验组和对照组，每组5只。吸取细菌纯培养液，腹腔注射试验组小鼠0.2 mL/只 （菌体含量6×109CFU/mL），5只对照组小鼠分别腹腔注射0.2 mL TSB液体培养基作对照。注射后隔离饲养，定期观察小鼠状态，并记录观察结果。

2.6 PCR鉴定及分型

挑取TSA琼脂平板上分离菌单菌落，接种于含5%血清的TSB液体培养基中，37 ℃培养箱，200 r/min，振荡培养24 h，提取细菌基因组DNA作模板，分别进行PCR扩增鉴定及分型检测。反应体系（25 μL）：10×Buffer（含MgCl2）2μL，上、下游引物各1 μL（10 pmol/L）。dNTP 2 μL，Tag DNA聚合酶0.2 μL，模板1 μL，加水补足至20 μL。扩增反应程序：94 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，30个循环：72 ℃ 10 min。取2 μL PCR产物，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。将PCR产物纯化回收后，连到pMD18-T载体，转化感受态大肠杆菌DH5a，挑单菌落，摇床培养过夜，提取质粒，并初步鉴定正确后，送生工生物工程（青岛）股份有限公司测序。

3 结果与分析

3.1 直接涂片镜检

肝脏、脾脏触片后革兰氏染色后镜检，可见单个、散在的红色短杆状细菌，符合巴氏杆菌特性。

3.2 细菌分离培养

普通琼脂平板上无细菌生长，在鲜血琼脂平板上37 ℃培养24 h后，可见灰白色、半透明、露珠样、光滑圆润、边缘整齐菌液。挑取单个菌落涂片进行革兰氏染色，镜检为革兰氏阴性、两端钝圆、中间微凸，单个存在、散在排列的短小杆菌。在普通琼脂平板培养基上无细菌生长。

3.3 生化试验

结果见表1，所分离巴氏杆菌不能发酵水杨苷、肌醇、鼠李糖、卫矛醇、麦芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能发酵葡萄糖、纤维二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇， V-P试验阴性，靛基质试验阳性，与巴氏杆菌的生化特征一致。

表1 分离菌的生化反应结果

3.4 药物敏感性试验

由表2可知，分离菌对头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感，对环丙沙星、阿米卡星、磷霉素、庆大霉素、氨苄西林中度敏感，对阿奇霉素、大观霉素、强力霉素、四环素、卡那霉素、林可霉素耐药。

表2 分离菌株的药物敏感性试验结果 mm

3.5 致病性试验

小鼠注射分离菌液4 h后，采食减少，不爱运动，呼吸急促，16 h后被毛粗乱，眼睑水肿、四肢发绀、对外界刺激反应迟钝，24 h后开始出现死亡，72 h内试验组小鼠全部死亡。剖检可见小鼠肝脏有白色坏死点、肺脏出血、脾脏肿大、出血，肠道出血。取肝脏组织触片，革兰氏染色镜检，可见呈革兰氏染色阴性的红色短小杆菌。对照组小白鼠全部健活。

3.6 PCR鉴定及分型

采用巴氏杆菌通用引物对分离菌进行PCR检测，结果显示，在457 bp位置有特异性目的条带，说明分离菌为巴氏杆菌。随后采用5对分型引物进行PCR检测，结果显示A型引物产物在1 048 bp出现特异性条带，其余均无目的条带，初步说明分离菌为A型巴氏杆菌。

3.7 基因克隆的测序分析

为进一步确认，将扩增的1 048 bp基因条带切胶回收，纯化后，连pMD18-T载体，转化DH5a感受态大肠杆菌，采用PCR方法筛选阳性克隆，将含有插入片段的阳性质粒送去测序。将测得序列与GenBank中收录的巴氏杆菌的进行同源性比较，结果显示，分离菌与巴氏杆菌A型序列同源性为100%。

4 讨论

猪巴氏杆菌病是猪的一种重要的细菌性传染病，呈散发和地方流行性，无明显季节性，当天气剧变、饲养条件改变、长途运输或猪群遭受其他应激因素影响时，或猪群抵抗力降低时容易诱发。猪巴氏杆菌病主要应以预防为主，加强饲养管理，饲喂优质全价配合饲料，饮用清洁水，提供适宜的温度和湿度，做好通风换气，较少猪群应激，做好其他常规疾病的免疫预防工作，也可以接种猪巴氏杆菌疫苗进行预防。发病后可用抗生素治疗，随细菌耐药性的增加，有时盲目用药，往往治疗效果不理想，需要借助实验室手段，提高猪群治疗效果。

本试验对东营某猪场死亡猪只送检病料进行细菌分离、鉴定，血清型鉴别，药敏试验和小鼠致病性试验。结果表明，所分离的A型巴氏杆菌，PCR血清分型方法的应用大幅缩短了巴氏杆菌血清分型鉴定时间，为进一步验证，测定相关基因序列，并比对分析，符合率为100%，为今后猪巴氏杆菌快速分型鉴定提供了可靠依据。生化试验结果表明，该分离菌生化特征与巴氏杆菌一致，不能发酵水杨苷、肌醇、鼠李糖、卫矛醇、麦芽糖、菊糖、棉籽糖、乳糖，能发酵葡萄糖、纤维二塘、蔗糖、木糖、果糖、半乳糖、海藻糖、山梨醇，V-P试验阴性，靛基质试验阳性。药敏试验结果表明，该分离株对头孢噻呋、恩诺沙星、氟苯尼考高度敏感，对阿奇霉素、大观霉素、强力霉素、四环素、卡那霉素、林可霉素耐药。建议猪场发生巴氏杆菌病后，分离病原菌，进行药敏试验，筛选有效药物，进行联合用药，或轮换和穿插用药，提高治疗效果，防止盲目用药及重复用药耐药性的产生，达到事半功倍的功效。致病性试验表明，分离菌可致小鼠发病，出现明显症状，最终导致试验组小鼠全部死亡，该分离菌具有较强毒力，为猪场自家苗研制奠定了基础。