一例猪圆环病毒2型和猪葡萄球菌混合感染导致仔猪渗出性皮炎的诊断与防控

张 维

（湖南省汨罗市畜牧水产服务中心，湖南 汨罗 414400）

猪圆环病毒2型（PCV2）属于圆环病毒属，是迄今为止发现的最小的DNA病毒之一，但该病原对宿主的致病性很高[1]。断奶仔猪多系统衰竭综合征主要由PCV2感染引起，其临床症状包括咳嗽、精神萎靡和呼吸困难等，但单独感染的病死率较低[2]。值得注意的是，PCV2感染可导致病畜出现免疫抑制，这导致其它病原的混合感染较严重，给养殖户造成巨大的经济损失，同时也导致疫病的诊断与防控较为困难[3]。猪葡萄球菌是引起仔猪渗出性皮炎的主要病原，仔猪感染该病原的主要临床症状包括消瘦、发热、皮肤表面有红斑或溃疡等，影响患猪采食和健康成长，严重时可导致死亡[4]。猪葡萄球菌属于机会致病菌，该病原广泛存在于猪体表，其感染健康猪群一般不发病，但猪群因病原感染或其它因素造成抵抗力下降时会导致该病相关临床症状出现，故在临床上该病主要是散发，但我们也不能忽视其对生猪养殖造成的危害与损失[5]。

2020年9月初，湖南汨罗市某猪场部分仔猪持续发病，临床症状主要包括渗出性皮炎、咳喘和体温升高等，病死猪体表末端（如耳朵和四肢等）发绀，剖检发现淋巴结肿大、肾脏有明显出血点，遂该企业负责人采集病死猪肺脏、肾脏、淋巴结等组织样品送至汨罗市畜牧水产服务中心进行病原检测，以期为相应的疫病防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

猪病变组织（肺脏、淋巴结及肾脏）由汨罗市某猪场提供。猪场兽医无菌采集组织样品后进行标记，低温送至汨罗市畜牧水产服务中心进行检测。

1.2 主要材料及试剂

动物组织DNA/RNA基因组提取试剂盒购自于赛默飞科技有限公司，cDNA反转录试剂盒、2×Taq PCR mix及DL 5 000 DNA Marker等产品均购自于Tankera；药敏纸片及相应细菌分离培养基为杭州微生物试剂有限公司产品。

用于检测猪瘟病毒（CSFV）、PCV2、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）及猪乙脑病毒（JEV）的特异性引物序列参考相关文献[6]，以上引物及细菌检测16S rRNA基因序列通用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 病毒检测

用灭菌眼科剪及手术刀切取少量组织，剪碎后置于离心管内，加入少量灭菌PBS溶液和钢珠后匀浆。将混合物高速离心，取200 μL上清液用于组织DNA/RNA基因组提取，其具体操作及注意事项均严格参考动物组织DNA/RNA基因组提取试剂盒提供的说明书，提取的基因组保存于-80 ℃，采用cDNA反转录试剂盒将基因组中的RNA反转录为cDNA，相应的产物保存于-20 ℃，待检。

采用PCR对组织样品中病原核酸进行检测，其PCR反应体系包含2×PCR mix 10.0 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA/cDNA模板1.0 μL及双蒸水8.0 μL。反应条件为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 5 min。每次PCR反应均设置阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为检测体系相应阳性样品核酸，阴性对照为双蒸水。PCR反应结束后取5.0 μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.4 细菌分离及鉴定

1.4.1 细菌分离及革兰氏染色鉴定 用灭菌接种环蘸取肺脏病变组织液接种于普通琼脂培养基表面，37 ℃恒温箱内培养18 h后观察培养基表面是否生长菌落，将单一菌落进行革兰氏染色，镜检。

1.4.2 细菌16S rRNA基因序列扩增及分析 取单一菌落在营养肉汤中扩增，在37 ℃环境下震荡12 h，其后用商业化试剂盒提取细菌基因组DNA。以基因组DNA为模板，其PCR体系和反应条件与上述一致。PCR反应结束后取5 μL产物进行琼脂糖凝胶电泳，将阳性产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。将返回序列进行拼接，将序列粘贴在NCBI进行核苷酸序列BLAST，分析该菌株序列与NCBI收录不同病原序列的核苷酸序列同源性。

1.5 药物敏感试验

采用K-B扩散法对分离菌进行药敏试验：将扩增菌液稀释至0.5麦氏标准浊度，取50 μL菌液涂布在普通琼脂培养基表面，待菌液稍干后便可贴上16种含不同抗生素的纸片，每个培养基表面贴4个，将平板置于37 ℃恒温箱内培养24 h，最后用卡尺测量不同纸片的抑菌圈直径，根据说明书判定标准对结果进行统计和分析。

2 结果

2.1 病毒检测结果

通过PCR法分别对组织样品中PCV2、PRV、PPV、CSFV、PRRSV和JEV核酸进行检测，发现被检测样品中仅PCV2核酸阳性（图1），未检出其它病原核酸。

图1 PCR扩增产物凝胶电泳结果

2.2 细菌分离及革兰氏染色鉴定结果

将组织液接种于普通琼脂培养基表面，18 h后发现平板表面生长出湿润、光滑的圆形菌落；进一步革兰氏染色结果发现该菌为革兰氏阳性菌，为葡萄状排列的球菌（图2）。

图2 分离菌株革兰氏染色镜检结果

2.3 分离菌16S rRNA基因序列扩增及分析

随机挑选3个单一菌落在营养肉汤中扩增，分别提取基因组DNA后，以通用引物16S rRNA-F、16S rRNA-R扩增其目的序列。PCR产物凝胶电泳结果如图3所示，3个菌株扩增PCR产物大小均为1 600 bp左右，与预测大小基本一致。将3个菌株PCR产物进行测序及拼接后，在NCBI网站进行BLAST对比分析，结果发现3个菌株序列与GenBank收录的猪葡萄球菌分离株（登陆号：CP030020.1）对应序列同源性均高于99.8%，与其它菌株对应序列同源性均低于98.0%，提示可将本次分离的菌株鉴定为猪葡萄球菌。

图3 菌株16S rRNA序列PCR扩增产物凝胶电泳结果

2.4 分离菌药敏试验结果

进一步对分离菌株进行药敏试验，结果发现该菌株对头孢唑林、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素、氟苯尼考、利福平、复方新诺明、万古霉素和新生霉素敏感，对头孢克肟、氨苄西林、青霉素和氨曲南抗生素耐药；对卡那霉素、氯霉素和氧氟沙星则中度耐药。

3 讨论

近年来，我国生猪养殖水平不断提高，随着养殖业对烈性传染病防控意识的提高，目前对猪场猪瘟、伪狂犬病等危害严重的传染病得到有效控制。然而，可导致猪群慢性消耗性疾病的病原仍然广泛存在，其中PCV2可感染不同发育阶段猪群，是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原之一，该病的流行对猪群健康造成巨大威胁[1]。此外，PCV2也是作为原发性感染导致继发感染PRRSV、猪链球菌、猪葡萄球菌等的主要病原，这无疑给临床诊断与疾病治疗带来了巨大的挑战。

本研究对汨罗市某规模化猪场疫情进行病因诊断，在组织中检测出PCV2核酸阳性，同时分离出一株猪葡萄球菌，结合临床诊断结果最终确诊该场发生疫情主要是由PCV2和猪葡萄球菌混合感染所致，进一步细菌耐药性试验结果表明，本次分离菌株对头孢唑林、头孢曲松、环丙沙星、庆大霉素和新生霉素等多种药物敏感，这为后续该场对此病的防治提供了科学依据。