湖南岳阳猪葡萄球菌分离鉴定及耐药性分析

范方程，王 文，彭娜娜，宁慧敏，董 伟

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

仔猪渗出性皮炎又称“猪油皮病”，该病是由猪葡萄球菌（Staphylococcus hyicus）感染所引起，不同阶段猪群对该病均易感，但多发于断奶仔猪和哺乳仔猪。仔猪感染该病后临床症状主要表现为消瘦、厌食、脱毛、皮肤表面红斑和浆液渗出形成湿疹性皮炎和渗出性皮炎等，严重时可导致发病猪脱水死亡[1]。仔猪渗出性皮炎的发生无明显的地域性和季节性，但在夏季和秋季多发，存在高发病率和死亡率的特点，给我国养猪业造成严重的经济损失[2]。此外，猪葡萄球菌也可感染人，但相关案例较为少见[3]。

目前我国养猪模式正逐渐从散养化向规模化、集约化养殖过渡，但大规模养殖容易导致疫病多发。猪葡萄球菌在猪场中十分常见，但该病感染导致的临床症状（仔猪渗出性皮炎）容易与其它疾病混淆，如猪疥螨病[4]。因此对于猪病的诊断，我们需要在临床诊断的基础上借助实验室技术进行诊断与分析，以快速而准确地对致病原进行确诊，为疾病的防治提供依据。2020年4月初，湖南岳阳某规模化猪场部分仔猪发生渗出性皮炎，笔者通过临床观察结合实验室技术诊断结果，最终确定该病由猪葡萄球菌感染引起，且进一步试验发现该致病菌对部分抗生素具有耐药性，其研究结果为该病的进一步防控提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源 湖南岳阳某规模化猪场饲养繁殖母猪400余头，2020年4月初该场产房部分栏舍仔猪出现渗出性皮炎，且有数十头仔猪死亡。为探究发病原因，该场兽医于4月中旬无菌采集病死猪心脏、肺脏和病变皮肤组织送至湖南农业大学动物医学院进行病原诊断。

1.1.2 主要试剂 细菌基因组DNA抽提试剂盒、2×Taq master mix、DL 5 000 DNA Marker等试剂均购自于TakaRa公司；药敏纸片购自于杭州微生物试剂有限公司；葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖和果糖等购自于国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原分离与革兰氏染色鉴定 使用灭菌眼科剪和手术刀切取少量心脏、肺脏和皮肤病变组织混合后切碎，与适量灭菌生理盐水混合，加入磁珠高速匀浆，离心后取上清液。在无菌操作台用灭菌接种环蘸取少量上清液接种在普通琼脂培养基表面，37 ℃培养24 h，观察培养基表面是否有菌落形成。如果有，则用革兰氏染色法对分离菌株进行染色，随后在光学显微镜下观察菌株形态。

1.2.2 生化鉴定 将分离的菌株接种于普通培养基进行培养与纯化，然后将单一菌落分别接种在葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等微量生化鉴定管，37 ℃培养48 h，统计试验结果。

1.2.3 分离菌株16S rRNA基因序列扩增及测序 根据参考文献[5]合成用于PCR扩增细菌16S rRNA基因序列通用引物，16S rRNA-27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；16S rRNA-1492R：5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由北京擎科生物科技有限公司长沙分公司合成。

将分离菌株接种在液体琼脂培养基中扩增，然后取适量菌液用于DNA基因组提取，其具体步骤参考相关试剂盒说明书进行。以提取菌株基因组为模板，通过PCR法对其16S rRNA基因序列进行扩增。其PCR体系（50.0 μL）包括2×PCR mix 25 μL、上下游引物各1 μL、DNA模板3 μL及双蒸水20 μL，每次反应均设置阳性对照和阴性对照，其模板分别为已知葡萄球菌DNA和双蒸水；扩增条件为94 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃90 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR反应结束后取5 μL产物进行凝胶电泳，将PCR阳性产物送至北京擎科生物科技有限公司长沙分公司双向测序。

1.2.4 分离株16S rRNA基因序列分析 将测序结果用DNA Star 5.0软件进行拼接，其后在NCBI上下载猪葡萄球菌及其它猪常见细菌性病原的16S rRNA基因序列。应用DNA Star 5.0软件分析本文获得序列与参考菌株核苷酸序列同源性，同时采用MEGA 6.0软件中的Neighbor Joining法构建系统发育树。

1.2.5 动物试验 将12只日龄、体重和性别一致的昆明小鼠分为2组，每组6只，对组Ⅰ小鼠腹腔注射分离菌原液0.2 mL/只，组Ⅱ腹腔注射等体积的生理盐水。对各组小鼠攻毒后观察其临床症状及体重变化等，并记录相应的结果。

1.2.6 药敏试验 采用药敏纸片扩散法对分离的致病菌进行药敏试验：将分离纯化菌稀释至1×108CFU/mL，取100 μL稀释菌液均匀涂布于普通琼脂培养基表面，待菌液稍干，取不同药敏纸片贴于培养基表面，置于37 ℃恒温培养24 h后测定不同药敏纸片抑菌圈直径，根据该产品相关判定标准对结果进行分析。

2 结果

2.1 细菌分离鉴定及生化试验结果

将病料组织匀浆后取上清液接种于普通琼脂培养基中进行细菌分离，在37 ℃培养24 h后发现培养基表面长出边缘整齐的乳白色光滑菌落；进一步革兰氏染色结果如图1所示：菌体呈蓝紫色球状，为革兰氏阳性菌，部分菌体单个或成对存在，大多数菌体聚集在一起呈葡萄串状；而生化试验鉴定结果显示，葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、果糖等指标为阳性，硫化氢、V-P试验等为阴性（表1）。

图1 分离菌革兰氏染色镜检结果

表1 分离菌生化试验结果

2.2 分离菌株16S rRNA基因序列扩增结果及序列分析

以该菌株基因组为模板，用PCR法对其16S rDNA基因序列进行扩增，凝胶电泳结果如图2所示，该菌株16S rDNA基因PCR产物大小约1 500 bp，与预期片段大小基本一致，且阴性和阳性对照成立。

图2 分离菌株16S rDNA扩增PCR产物凝胶电泳结果

进一步序列分析结果发现，该菌株16S rRNA基因序列与已知猪葡萄球菌分离株（登录号：MW485735）同源性最高，为99.62%，但与其它细菌性病原对应序列同源性相对较低。遗传进化分析结果如图3所示，本试验分离的菌株与已知猪源葡萄球菌（MW485735）同属一个分支，由此推断本文获得的菌株为猪葡萄球菌。

图3 分离株16S rRNA基因序列与相关致病菌遗传进化分析结果

2.3 小鼠致病性试验结果

组Ⅰ小鼠接种猪葡萄球菌5～7 d后，精神萎靡、不愿活动，肉眼可见接种部位皮肤处有被毛脱落和炎性物质渗出，背部皮肤出现红色疱疹，随后有溃烂等，但无小鼠死亡现象。且与组Ⅱ小鼠相比，其体重和采食量均有所下降。

2.4 药敏试验结果

采用KB扩散法检测该分离菌对不同抗生素的敏感性，结果如表2所示，分离菌株对青霉素、氨苄西林、头孢曲松、头孢哌酮、阿莫西林、氟苯尼考、万古霉素、多西环素、磺胺异噁唑敏感，对诺氟沙星、环丙沙星中敏，对林可霉素耐药。

表2 分离菌株耐药性分析结果

3 讨论

猪葡萄球菌是一种机会致病菌，广泛存在于自然环境中，当动物机体免疫力下降时病原菌便可通过皮肤损伤处和皮肤黏膜感染宿主。猪是该病原的易感动物，该病感染可引起猪关节炎、败血症及皮肤化脓。近年来，猪葡萄球菌病在我国各地猪场均有发生，这无疑严重危害我国养猪业的健康发展，同时对养猪从业人员健康也造成威胁。

2020年4月初，湖南岳阳某规模化猪场部分仔猪暴发疑似猪葡萄球菌感染导致的仔猪渗出性皮炎，通过细菌分离、革兰氏染色及16S rRNA基因序列扩增与分析发现该致病菌为猪葡萄球菌。为初步分析本试验分离株葡萄球菌的致病性，以昆明小鼠为动物模型进行初步探究，结果发现该菌可导致小鼠出现较严重的临床症状，如皮肤接种处有被毛脱落或溃疡等，但未对小鼠致死，这在一定程度上说明该菌具有较低的致病性。

养猪业的快速发展在一定程度上得益于抗生素的使用，但这也导致猪场各种耐药菌的产生。梁荣等[6]对广东省猪源葡萄球菌耐药性分析结果表明，1 485株猪源葡萄球菌对红霉素、四环素、克林霉素、氟苯尼考等抗生素耐药性严重，其耐药率分别为91.0%、90.2%、84.6%和82.0%；岑静等[7]研究发现，湖南地区分离的猪葡萄球菌对青霉素、庆大霉素、林可霉素和氟苯尼考等具有耐药性。但本试验分离的菌株对大部分被测抗生素十分敏感，如青霉素、氨苄西林和氟苯尼考等，仅对林可霉素耐药。与该场负责人沟通得知该场平时较少使用抗生素，这可能是该场分离葡萄球菌对大部分常用抗生素敏感的主要原因。