儿童侵袭性感染大肠埃希菌的耐药情况

李伟，陶云珍，王运中，徐俊，魏佳，季健(通信作者)

苏州大学附属儿童医院 (江苏苏州 215025)

大肠埃希菌是儿童感染性疾病常见的病原菌，可定植在肠道，也可引起呼吸道感染、尿道感染、血流感染等肠外感染[1]。近年来，随着免疫抑制剂使用和侵入性治疗措施的开展，儿童大肠埃希菌血流感染所致的脓毒症发病率明显增高，同时其可侵入脑脊液，导致脑膜炎或脑膜脑炎[2]。大肠埃希菌毒力强，所致的脓毒症、脑膜炎或脑膜脑炎等侵袭性感染是儿童尤其是新生儿重要感染性疾病，可造成患儿各系统严重损害，甚至危及生命[3]。此外，随着抗菌药物的广泛使用，大肠埃希菌耐药现象日趋严重[4]。基于此，本研究探讨苏州地区儿童血液和脑脊液等侵袭性感染大肠埃希菌的分布与耐药情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株

以苏州大学附属儿童医院2018年1月至2019年12月患儿血液、脑脊液等穿刺获得的体液标本中检出的大肠埃希菌作为研究对象(剔除同一患儿重复菌株)，所有菌株均采用全自动基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS，BRUKER)鉴定。

1.2 方法

1.2.1细菌基因组提取

采用煮沸-冷冻法快速提取大肠埃希菌基因组DNA[5]；采用接种环挑取一环大肠埃希菌菌落，将其置于含有1 ml无菌水的EP管中，振荡混匀，然后将EP管置于100 ℃金属浴中30 min，取出后放入-20 ℃冰箱冷冻30 min，之后室温完全解冻，然后以10 000 rpm离心2 min，取上清液加入新的EP试管中，采用紫外分光光度法测定其浓度和纯度后将其置于-20 ℃冰箱作为模板保存备用[6]。

1.2.2药敏试验

采用全自动细菌药敏分析仪(VITEK 2 compact system，bioMérieux)和纸片扩散法对分离的大肠埃希菌进行药敏分析，结果参照美国国家和临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)最新标准判读[7]。

1.2.3β-内酰胺类抗生素耐药相关基因检测

采用文献中报道的碳青霉烯酶基因(NDM-1、OXA-1、VIM-1、KPC-2、IMP-4、AIM-1、GIM-1、SIM-1、SPM-1、BIC-1、DIM-1)[8]、超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)基因(TEM-1、CTX-M-14、SHV-1、VEB-1、PER-1)[9]和AmpC酶基因(ACT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2、DHA-1、ACC-1、MOX-1、EBC-1)引物序列[10]，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司合成；采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)检测大肠埃希菌中各基因携带情况，PCR反应总体积25 μl︰ddH2O 9.5 μl，上下游引物(10 μΜ)各1 μl，DNA模板1 μl，2×Rapid Taq Master Mix(Vazyme)12.5 μl，扩增条件为94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s(30个循环)，72 ℃ 10 min；采用2%琼脂糖凝胶电泳法分析PCR扩增产物，其均委托北京擎科生物科技有限公司上海分公司测序并进行比对。

1.3 质量控制

采用大肠埃希菌标准菌株ATCC25922进行质量控制。

1.4 统计学处理

采用WHONET 5.6软件对数据进行统计学分析。

2 结果

2.1 临床分布

本研究涉及67例患儿，其中男44例(65.67%)，女23例(34.33%)，男女比例约为1.91∶1；年龄<1个月30例(44.78%)，1～12个月21例(31.34%)，1～18岁16例(23.88%)；共分离到67株侵袭性大肠埃希菌，其中血液标本中59株(88.06%)，脑脊液标本中8株(11.94%)，主要分布在新生儿科、血液科、重症监护室等科室，见表1。

表1 儿童侵袭性大肠埃希菌的科室分布情况(67株)

2.2 药敏试验结果

药敏试验结果显示，67株侵袭性大肠埃希菌对亚胺培南、美罗培南、厄他培南和丁胺卡那霉素均不耐药，对氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、环丙沙星、哌拉西林/他唑巴坦、庆大霉素、妥布霉素、头孢替坦、头孢他啶、头孢吡肟、头孢唑啉、头孢西丁、头孢唑肟、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率也较低，见表2；同时，产ESBLs的侵袭性大肠埃希菌有25株，产酶率为37.31%。

表2 儿童侵袭性大肠埃希菌的耐药情况

2.3 耐药基因携带情况

PCR结果显示，67株侵袭性大肠埃希菌中检出的碳青霉烯酶基因为NDM-1和OXA-1，ESBLs基因为TEM-1和CTX-M-14，AmpC酶基因为ACT-1、FOX-1、CIT-1、CMY-2和DHA-1，其余碳青霉烯酶基因、ESBLs基因和AmpC酶基因均未检出，见表3。

表3 儿童侵袭性大肠埃希菌的耐药基因分布情况(67株)

3 讨论

大肠埃希菌是院内感染重要病原菌，也是儿童感染性疾病主要病原菌[11]。有资料显示，大肠埃希菌在医院感染标本中的分离率达50%，其中产ESBLs菌株的分离率更高，容易引起暴发流行[12]。此外，碳青霉烯酶耐药的大肠埃希菌(carbapenem-resistant Escherichia coli，CREC)已成为全世界的公共卫生威胁，而且碳青霉烯酶、ESBLs、AmpC酶等耐药基因极易在菌株间传播，导致耐药菌产生和扩散，从而影响治疗效果[7-10]。本研究结果显示，67株侵袭性大肠埃希菌整体耐药率不高，但对氨苄西林和复方新诺明有很高的耐药率，对头孢呋辛、头孢噻肟、头孢曲松和左氧氟沙星有较高耐药率，这些药物治疗效果可能不佳；另外，本研究中未检出亚胺培南、美罗培南或厄他培南耐药的侵袭性大肠埃希菌，说明67株侵袭性大肠埃希菌中无高耐药的CREC，提示碳青霉烯类药物对大肠埃希菌有较高的稳定性。

儿童用药有其独特性，且有很多临床限制，根据药敏试验结果，可以优先选择毒性小的药物，合理选择使用抗生素[13]。病原菌耐药基因检测也是提高用药针对性和治疗有效性的关键[14-15]。本研究中共检测了11种碳青霉烯酶基因，结果只检测到NDM-1基因2株和OXA-1基因1株，说明本研究中儿童侵袭性大肠埃希菌产耐碳青霉烯酶较少；5种ESBLs基因中，共检出TEM-1基因42株和CTX-M-14基因23株；8种AmpC酶基因中，共检出ACT-1基因43株、FOX-1基因30株、CIT-1基因2株、CMY-2基因2株和DHA-1基因1株。上述结果说明，本研究中儿童侵袭性感染大肠埃希菌β-内酰胺类抗生素耐药机制主要是携带TEM-1、CTX-M-14、ACT-1和FOX-1等基因。

综上所述，苏州地区儿童侵袭性感染大肠埃希菌整体耐药率不高，也未检出CREC，但是携带了较高比例的ESBLs基因和AmpC酶基因，应引起临床医师重视。