朱砂及其复方与氯化汞、甲基汞对小鼠肾转运体基因表达影响对比

隋 怡 杨 虹 田兴中 付中祥 时京珍

贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002

朱砂及含朱砂的中药含汞，汞被列入有毒重金属范畴，使其用药安全性遭受质疑。目前均以总汞含量为指标来评价含朱砂中药的安全性。然而，自然界中汞的形式多种多样，不同形式的汞其毒性差异巨大，以总汞含量为指标评价朱砂安全性似乎欠妥[1-4]。肾脏是汞的毒性靶器官之一。肾转运体种类众多，介导各种机体内、外源性物质自肾脏的排泄。本实验前期研究了小鼠连续灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物对小鼠肾转运体基因表达的影响[5]，发现与正常组小鼠相比，HgCl2组和MeHg组小鼠肾汞蓄积量显著升高、肾转运体基因(Oat1、Oat2、Oat3、Mrp2、Mrp4、Urat1)表达有显著性差异，其余各组以上基因的表达与正常组小鼠相比无显著性差异。表明与HgCl2和MeHg相比，朱砂及其复方对小鼠造成的肾转运体基因表达的影响相对较低。本次实验采用实时RT-PCR的方法，继续检测连续灌胃30 d后，朱砂安神丸及含汞化合物对小鼠肾转运体(Oatp4c1、Ost-α和Ost-β)基因表达的影响，从而进一步为科学的评价朱砂及含朱砂中药的安全性提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 清洁级健康成年雄性昆明种小鼠，体重18～22g，购自贵阳中医学院实验动物中心，动物许可证号：SCXK(黔)2002-0001。

1.1.2 药品 朱砂安神丸水蜜丸(哈药集团世一堂制药厂)、朱砂(毫州市京皖中药饮片厂，水飞炮制品)、HgS(美国Sigma公司)、HgCl2(贵州省万山特区矿产公司)、MeHg(美国Sigma公司)。药物的配制：以上各种药物均用去离子水配制。

1.1.3 试剂 Trizol(invitrogen公司，批号5194 1204)、高容量逆转录酶试剂盒(High Capacity Reverse Transcriptase Kit：Applied Biosystems,Foster City,CA,USA，批号0810067)、Power SYBR Green ®PCR Master Mix(Takara公司，批号0912197)、引物设计与合成(上海捷瑞生物工程有限公司)、焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC，北京索宝来科技有限公司，批号426A057)。

1.1.4 主要仪器 JA2003N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)、ND-2000(NaNoDop 2000)微量紫外-可见分光光度计(美国Thermo Scientific公司)、22331型多功能梯度PCR仪(Matercycler gradient，德国Eppendorf公司)、CFX-connect型荧光定量PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药 小鼠42只，随机分成7组，每组6只。分别为正常组、朱砂安神丸组(灌胃，1.8g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂组(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、朱砂高剂量组(灌胃，2g·kg-1，含汞1.7 g·kg-1)、HgS组(灌胃，0.2 g·kg-1，含汞0.17 g·kg-1)、HgCl2组(灌胃，0.032 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，约1/7朱砂中汞含量)、MeHg组(灌胃，0.026 g·kg-1，含汞0.024 g·kg-1，约1/7朱砂中汞含量)。每天灌胃给药1次，连续30 d，处死小鼠取肾组织，进行实时荧光定量RT-PCR检测。

1.2.2 实时RT-PCR法检测小鼠肾转运体基因的表达 RNA的提取、纯化与浓度检测：取50mg肾组织，加入1mL Trizol，冰上匀浆。离心后取上清液加入500 μL异丙醇沉淀RNA，75%乙醇充分洗涤3次后用DEPC水100μL溶解备用。紫外可见分光光度计检测RNA纯度，OD260/OD280>1.7认为RNA纯度达到要求，RNA浓度(ng·μL-1)=OD260·40。按检测的RNA浓度用DEPC水稀释，配制成200 ng·μL-1的RNA样品稀释液备用。

逆转录：取6 μL RNA稀释液按High Capacity RT试剂盒说明书逆转录成cDNA，用DEPC水稀释成浓度为10 ng·μL-1备用。引物序列见表1。

表1 RT-PCR所用引物

PCR扩增：配置15 μL反应体系，包括3 μL cDNA稀释液、7.5 μL Power SYBR Green PCR Master Mix、0.5 μL混合引物(表1)、4 μL DEPC水。反应条件：95 ℃×10 min，3个循环；95 ℃×10 s，60 ℃×1 min，40个循环；95 ℃×1 min，55 ℃×1 min，55 ℃×10 s，80个循环。以β-actin作为内参基因，根据结果对基因表达进行相对定量。

基因相对表达(%)=目的基因的表达/内参基因的表达×100。

2 结果

朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg对小鼠肾组织Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表达的影响， 与正常组相比，小鼠肾Oatp4c1基因的表达在朱砂安神丸组显著升高(P<0.05)； Ost-α、Ost-β的表达在HgCl2组和MeHg组均显著降低(P<0.05)。其余各组基因的表达与正常组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 朱砂安神丸、朱砂、HgS、HgCl2、MeHg对小鼠肾组织Oatp4c1、Ost-α、Ost-β基因表达的影响

3 讨论

自然界中汞的形式有很多，常见的汞以与硫结合的形式存在，即HgS的形式。HgS的口服吸收度较差，毒性较低；而汞的另外两种形式氯化汞和甲基汞，易于在海洋生物体内蓄积，主要造成严重的肝、肾和神经毒性[1]。不同形式的汞毒性差异巨大。朱砂安神丸全方含汞约为9%，主要为HgS，目前以总汞含量评价含朱砂中药用药安全性。然而HgS的水溶性小、口服吸收率低。HgCl2为可溶性二价汞，体内吸收率远高于HgS。MeHg为脂溶性有机汞，很容易穿透细胞膜，易于蓄积造成毒性。

课题组前期研究发现，HgCl2组和MeHg组小鼠肾转运体基因表达与正常组相比有显著性差异，朱砂及朱砂安神丸对肾转运体基因表达影响较小[5]。由于肾脏转运体对肾功蓄积和肾脏毒性起到重要的作用[5]，因此课题组从基因水平考察不同形式的汞对肾转运体基因表达的影响。

有机阴离子转运多肽Oatp4c1表达于肾近端小管上皮细胞基底膜，介导有机阴离子从肾小管周组织转运至肾小管上皮细胞内[6]。Oatp4c1底物众多，其中包括cAMP等机体内源性代谢产物[6]。cAMP为某些细胞信号传导通路中重要的第二信使，其在细胞内含量升高会激活PKA，激活的PKA使特定蛋白质磷酸化，从而发挥生理作用。在心肌细胞中，PKA激活会使Ca2+通道开放，使得心肌自律细胞4期自动去极化加快，为快速心律失常危险因素[7]。心肌细胞内cAMP的消除有多种方式，心肌细胞上存在一些转运体，可以直接将cAMP排出心肌细胞，降低心肌细胞内cAMP水平[8]。本次实验结果中，朱砂安神丸组小鼠肾脏中Oatp4c1基因的表达与正常组相比显著增加，表达的加强可能会增强肾脏cAMP的排泄，使心肌细胞内cAMP维持在较低水平。

有机溶质转运体α、β(Ostα、Ostβ)为胆汁酸转运体。其在不同部位表达有不同的生理意义：在小肠中主要表达介导胆汁酸的吸收；在肝脏表达介导胆汁酸自肝细胞进入血液循环；在肾脏表达介导胆汁酸及其代谢产物的重吸收[9]。肝细胞合成胆汁酸，其与钠、钾离子形成的胆盐有助于脂肪在肠道内的乳化、吸收。胆汁酸的排泄主要是通过肠道和肾[10]，健康机体能通过加强胆汁酸肾小管重吸收等方式，最大程度地保留体内胆汁酸；而在病理情况下(如肝脏损害、胆汁淤积)，机体会调节胆汁酸转运体的表达，加强胆汁酸自粪或尿的排泄。课题组前期的实验结果显示[11]，小鼠灌胃 0.032 g·kg-1氯化汞30 d可见肝组织炎症细胞浸润、肝细胞水肿。灌胃 0.026g·kg-1甲基汞30 d可见肝组织大量炎性细胞浸润，肝细胞水肿明显，或坏死，显示出氯化汞和甲基汞对肝脏的损害。本实验中，在氯化汞组、甲基汞组小鼠肾内Ost-α、Ost-β基因表达式显著下调，联系之前观测到的氯化汞和甲基汞造成的肝脏损伤，课题组认为这是一种机体的自我保护机制，即肝脏损害诱导肾内Ost-α、Ost-β基因表达下调，降低胆汁酸在肾内重吸，加速其排泄，缓解肝脏损伤。而与正常组相比，其余各组Ost-α、Ost-β基因表达无显著性差异。表明不同形式的汞对小鼠肾转运体基因表达影响差异巨大，其毒理作用有待进一步考量。