基于多息薄层色谱法的黄甲软肝颗粒的鉴别研究

王宗权 黄朝情 黄志辉 高 进 张丽丽 张保献* 滕利荣

1.盈科瑞(珠海)创新医药制造有限公司，广东 珠海 519040；2.北京盈科瑞药物研究院有限公司，北京 102200；3.盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司/国家中药现代化工程技术研究中心新型递药系统分中心/广东省雾化吸入制剂工程技术研究中心，广东 珠海 519000；4.吉林大学珠海学院，广东 珠海 519041

黄甲软肝颗粒是纯中药复方制剂，由黄芪、鳖甲、灵芝、丹参等10 味中药组成。具有益气舒肝、活血软坚的功效。用于肝纤维化和早期肝硬化脾虚肝郁，气血瘀阻证。症见胁肋刺痛或胀痛，食欲不振，脘腹胀满，大便溏烂，神疲乏力，面色晦暗，舌暗，苔薄，脉弦。薄层色谱法是中药复方制剂鉴别中最常用的定性方法，具有分离效率高、操作方便、分析速度快、专属性好等特点[1]。近年来，随着新方法、新技术的应用，薄层色谱鉴别技术取得了长足的发展，如中药薄层指纹图谱[2]、加压薄层色谱[3]、微乳薄层色谱[4]、二维薄层色谱[5]等。但目前常用的薄层色谱鉴别法多为一块薄层板检测一种供试品，使用一种展开剂及显色剂的情况下，多数可鉴别出一种或两种药味，并且样品前处理复杂。基于多息法、整体观在中药质量控制中的应用，针对中药薄层色谱鉴别法的现状，提出了多息薄层色谱鉴别法[6]。探索中药复方制剂的多息薄层色谱鉴别技术，有利于提升中药复方制剂的检验水平，减少检测成本，节约检测时间和降低环境污染。本研究对黄甲软肝颗粒中的黄芪、丹参、三七、葛根、赤芍、柴胡建立了多息薄层色谱鉴别方法，在2块薄层板上鉴别了6味药，为建立中药复方制剂的快速薄层色谱鉴别方法提供了思路。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 HWS-26型数显恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)；SQP型电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-500DE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；WFH-201B型暗箱式紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；DHG-9070A型鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；硅胶G薄层板(青岛海洋化分厂，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm)；硅胶 G薄层板(烟台市化学工业研究所，10 cm×20 cm，厚度：0.2～0.25 mm)；点样方式：接触式条带状点样。

1.2 试剂与试药 香草醛、甲醇、三氯甲烷、甲苯、对二甲氨基苯甲醛、乙酸乙酯、乙醚、正丁醇、氨试液、硫酸等均为分析纯。

黄芪甲苷对照品(批号：110781-201717)；葛根素对照品(批号：110752-201816)；芍药苷对照品(批号：110736-201943)；丹参酮IIA对照品(批号：110766-201721)；三七皂苷R1对照品(批号：110745-201820)；柴胡皂苷a对照品(批号：110777-201912)；柴胡皂苷d对照品(批号：110778-201912)；三七对照药材(批号：120941-201409)；柴胡对照药材(批号：120992-201509)均购于中国食品药品检定研究院。

黄甲软肝颗粒，批号：20190615，由盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司提供。

各药味阴性样品，是从处方中减去待鉴别药味后按照已经确定的工艺条件制备而成，均由盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 丹参、葛根、赤芍薄层鉴别

2.1.1 样品的制备 称取供试品颗粒3 g，研细，加入甲醇10 mL，超声处理30 min，滤过，滤液40 ℃挥干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另分别取缺丹参的阴性样品、缺葛根的阴性样品、缺赤芍的阴性样品各3 g，同法制成阴性样品溶液。再分别取丹参酮IIA、葛根素及芍药苷对照品适量，分别加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 展开显色 吸取上述供试品溶液4 μL和阴性样品溶液各4 μL、对照品溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使呈条带状，先以三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)为展开剂，展开，展至约5 cm，取出，晾干，再以甲苯-乙酸乙酯(24∶1)为展开剂，展开，展至约8 cm，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，置105 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。

2.1.3 结果 供试品色谱中，丹参酮IIA对照品显示红色的斑点，样品中相应的位置上有红色的斑点较明显，对应的阴性样品无干扰。葛根素对照品显示蓝色荧光斑点，样品中相应的位置上有蓝色荧光斑点较明显，对应的阴性样品无干扰。芍药苷对照品显示蓝紫色的斑点，样品中相应的位置上有蓝紫色的斑点，对应的阴性样品无干扰。如图1所示。

2.2 黄芪、三七、柴胡薄层鉴别

2.2.1 样品的制备 称取供试品颗粒3 g，研细，加入甲醇25 mL，超声处理30 min，滤过，滤液水浴蒸干，残渣加水25 mL使溶解，用乙醚振摇提取3次，每次25 mL，弃去乙醚液，水液用水饱和正丁醇振摇提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤3次，每次25 mL，弃去氨试液，用正丁醇饱和水洗涤2次，每次20 mL，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另分别取缺黄芪的阴性样品、缺三七的阴性样品、缺柴胡的阴性样品各3 g，同法制成阴性样品溶液。再分别取黄芪甲苷、三七皂苷R1及柴胡皂苷a对照品适量，分别加甲醇制成1 mL含1 mg的溶液，作为对照品溶液。继取三七对照药材0.5 g，加水25 mL回流提取30 min，放冷，滤过，滤液自“用乙醚振摇提取3次”起，同法制成对照药材溶液。

2.2.2 展开显色 吸取上述供试品溶液和阴性样品溶液各4 μL、对照品溶液和对照药材溶液各2 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，使呈条带状，以正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)的上层溶液为展开剂，展开，展至约17 cm，取出，晾干，喷以含2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，80 ℃加热至斑点显色清晰，分别置日光和紫外光灯(365 nm)下检视。

2.2.3 结果 供试品色谱中，黄芪甲苷对照品显示棕褐色斑点，样品中相应的位置上有棕褐色斑点，对应的阴性样品无干扰。三七对照药材显示4个紫色的斑点，样品中相应的位置上有紫色的斑点，三七皂苷R1对照品相应位置上有相同的紫色斑点，对应的阴性样品无干扰。柴胡皂苷a对照品显示黄绿色的荧光斑点，样品中相应的位置上有黄绿色的荧光斑点较明显，对应的阴性样品无干扰。如图2所示。

3 讨论

本实验按照处方中所含有药味主要的化学成分的极性进行初步分类，并且参照处方组成以及制备工艺，将欲鉴别的黄甲软肝颗粒中6味药，分为皂苷类成分及其他类成分。对药典中各药味的鉴别方法进行细致分析，由于有些供试品制备过程及所用展开剂极性相似，故尝试同步检识。再查阅相关文献，摸索不同比例的展开剂，经过反复试验，寻找合适的展开条件。

其他类成分(比如黄酮类、单萜类、菲醌类)制备方法简单，直接用甲醇超声提取制备。而皂苷类成分因样品成分复杂，干扰较大，故将样品前处理方法加以改进。设计了2种供试品溶液的制备方法：①采用甲醇直接超声提取制备；②采用甲醇超声提取，乙醚萃取后弃掉，再用水饱和正丁醇萃取制备(用氨试液及正丁醇饱和水溶液洗涤)。结果表明，三味药(丹参、葛根、赤芍)采用方法①可以达到斑点清晰，分离效果好，简便易行。另三味药(黄芪、三七、柴胡)需采用方法②可以达到斑点清晰，分离效果好。由于黄芪、三七、柴胡均含皂苷类化合物，易溶于水、醇类等极性较大的溶剂，在水饱和正丁醇中有较大的溶解度。本研究用乙醚除去部分脂溶性杂质，在水饱和正丁醇中提取。又由于一些黄酮类化合物对皂苷类化合物的薄层鉴别干扰较大，故萃取液必须进行碱化，洗涤掉部分干扰成分，还可以使黄芪甲苷的含量提高(黄芪皂苷I、黄芪皂苷II碱化后可以转化为黄芪甲苷)。这样就得到了清晰的薄层色谱图，阴性无干扰。

研究中采用硅胶预制薄层板考察了不同展开剂系统及比例的展开效果。在丹参、葛根、赤芍的薄层鉴别中，参考葛根药材的展开剂三氯甲烷-甲醇-水(7∶2.5∶0.25)[7]进行展开，由于丹参酮IIA在此条件下展开效果不好，故参考丹参药材薄层检测的二次展开方法对丹参酮IIA进行鉴别，结果阴性无干扰，专属性强，适合作为黄甲软肝颗粒中丹参、葛根、赤芍薄层鉴别方法。在黄芪、三七、柴胡的薄层鉴别中，对展开剂进行了选择对比，正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)；三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)；三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)[8]等展开条件，经多次展开试验，优选出正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶3∶5)为试验展开条件，其他展开剂下易出现边缘效应且样品斑点分离度较差。根据文献[9]报道，柴胡皂苷d的醚键在高温或酸性条件下可断裂生成柴胡皂苷b2。而黄甲软肝颗粒制备时柴胡经过长时间水煮，故本方不能使用柴胡对照药材及柴胡皂苷d来鉴别。

多息薄层鉴别法的优势在于实现了一板多信息鉴别，完成了6味药的鉴别。样品处理和展开程序及成本大大降低，有效提高了检测效率，节约了成本，突破了药典的传统鉴别模式。本研究建立了黄甲软肝颗粒的多息薄层色谱鉴别法，探索了一种简便、省时、高效的鉴别方法，提升了黄甲软肝颗粒的质量控制水平，为中药复方制剂的质量控制提供了思路。