花生油中黄曲霉毒素B1高效液相色谱 检测方法的探索与研究

◎ 唐国芳

（贵州省黔东南州食品药品检验检测中心，贵州 凯里 556000）

黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是常见的食品污染物之一，其危害极大。黄曲霉毒素有很多种，其中黄曲霉毒素B1（AFTB1）毒性最强，它的毒性比砒霜强几十倍，对肝脏有严重的损伤，是Ⅰ类致癌物。AFTB1化学性质相对稳定，很难溶于水，高温高压对它的破坏程度也很小，接近300 ℃时才开始裂解，所以一般的烹调方法对它基本上没有作用。花生是容易感染黄曲霉的农作物之一，黄曲霉毒素对花生具有极高的亲和性。黄曲霉的侵染和黄曲霉毒素的产生不仅发生在花生的种植过程中，而且在加工过程中也会产生。黄曲霉菌广泛存在于土壤中，菌丝生长时易产生毒素，而生长在土壤之中的花生最容易感染黄曲霉毒素。制作花生油的过程中，大量的花生经过压榨，其中霉变花生所含的黄曲霉毒素很可能经由这个过程出现在花生油中。

国家市场监督管理总局规定，黄曲霉毒素B1作为重点食品污染物是大部分食品的必检项目之一。《食品安全国家标准 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）[1]标准规定，花生（油）和玉米（油）的黄曲霉毒素B1限值均为20 μg kg-1，在所有黄曲霉毒素B1限量的食物中限值最高。

本文根据中国检验检疫科学研究院测试评价中心下达的能力验证计划——《花生油中黄曲霉毒素B1的测定》（ACAS-PT833—2019），以中检院提供的盲样为样品，以《食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》（GB 5009.22—2016）[2]标准为依据，通过优化实验条件来探索花生油中黄曲霉毒素B1的检测方法，以加标测回收率来验证方法的可行性。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱仪，荧光检测器，光化学柱后衍生器，3 mL Pribolab黄曲霉毒素总量免疫亲和柱。

甲醇-水（70+30）；磷酸盐缓冲溶液（PBS）：8.00 g氯化钠、1.20 g磷酸氢二钠、0.20 g磷酸二氢钾、0.20 g氯化钾，用900 mL水溶解，用盐酸调节pH至7.4，用水定容至1 000 mL；1% Triton X-100（或吐温-20）的PBS： 取10 mL Triton X-100， 用PBS定 容 至1 000 mL。所用试剂均为分析纯。

黄曲霉毒素B1（AFTB1）标准溶液，标准值2.0 μg·mL-1，由国家农业环境保护科研监测所提供，编号SB05-195-2008。

1.2 分析步骤

1.2.1 标准溶液的配制

将AFTB1标准溶液用甲醇配制成200 ng·mL-1的标准储备液，再用初始流动相配制成浓度为0.625 ng·mL-1、1.250 ng·mL-1、2.500 ng·mL-1、5.000 ng·mL-1、10.000 ng·mL-1、20.000 ng·mL-1、40.000 ng·mL-1的 标准系列工作液。

1.2.2 样品前处理

准确称取5 g样品（精确至0.001 g）于50 mL离心管中，准确加入20 mL甲醇-水溶液（70+30）提取液，涡旋混匀，置于涡旋振荡器中振荡20 min，在4 000 r·min-1下离心10 min，准确移取4 mL上清液，加入40 mL左右1% Triton X-100（吐温-20）的PBS，混匀，待过柱净化。

1.3 样品的净化

1.3.1 免疫亲和柱的准备

将低温下保存的免疫亲和柱恢复至室温。

1.3.2 试样的净化

免疫亲和柱内液体放弃后，将1.2.2处理好的样品移至50 mL注射筒中，调节下滴速度，控制样液以1～3 mL·min-1的速度稳定下滴，待样液滴完后，往注射器筒内分两次加入20 mL水，以稳定的流速淋洗免疫亲和柱，待水滴完后，用真空泵抽干亲和柱，最后用4 mL甲醇分4次洗脱，控制洗脱速度在1～3 mL·min-1，收集洗脱液，在500 ℃下用氮气缓缓吹至近干，用初始流动相定容至1 mL，涡旋30 s，过0.22 μm有机滤膜，上机检测。

1.4 加标样品的处理

称取空白样品5 g（精确至0.001 g），准确加入0.5 mL 40 ng·mL-1的黄曲霉毒素B1的标准溶液，和样品一起平行处理、净化、上机检测算回收率。

1.5 柱后光化学衍生法液相色谱参考条件

流动相：A相甲醇，C相乙腈，D相水（体积比30∶10∶60）；色谱柱：Agilent Poroshell 120 C184.6×150 mm；流速：1.0 mL·min-1；进样量：30 μL；柱温：400 ℃；激发波长：360 nm；发射波长：440 nm。

1.6 标准曲线绘制

系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测，以峰面积为纵坐标、以样品浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.7 样品的测定

试样中AFTB1的含量计算公式为：

式（1）中：X-试样中AFTB1的含量，单位为μg·kg-1；C-进样溶液中AFTB1按照外标法在标准曲线中对应的浓度，单位为ng·mL-1；V1-试样提取液体积，单位为mL；V3-样品经免疫亲和柱净化洗脱后的最终定容体积，单位为mL；V2-用于免疫亲和柱的分取样品体积，单位为mL；m-样品称样量，单位为g。

2 结果与分析

2.1 结果

得到标准曲线回归方程如图1所示，标准曲线线性关系良好，相关线性系数达到0.999 9，线性范围在0.625 ～ 40.000 ng·mL-1。

图1 标准曲线图

空白样品加标回收，回收率达到81.1%。空白加标图谱图如图2所示。

用同样的条件进黄曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2的混合标准溶液，分离效果很好，如图3所示。

图2 空白加标图谱图

图3 黄曲霉菌毒素G1、G2、B1、B2色谱图

实验结果经中检院测试评价中心审核，与测试中心通报的指定值比较，两个样品Z值分别为0.1和0.2，获得满意结果。

2.2 实验分析

2.2.1 优化实验条件

GB 5009.22—2016的分析方法中流动相甲醇、乙腈、水的比例25∶25∶50，经过探索，将甲醇、乙腈、水的比例调整为30∶10∶60，能让AFTB1、AFTB2、AFTG1、AFTG14种物质达到理想的分离状态。

在样品前处理时加入吐温试剂时，国标添加量为23 mL，为了降低缓冲液中甲醇的浓度，本实验添加量为40 mL。AFTB1易溶于甲醇，先前上柱的提取液要弃去，让提取液中提取出来AFTB1抗源与免疫亲和柱中的AFTB1抗体能够更充分有效的结合在一起。

洗脱的甲醇与国标相比多了2 mL，这样虽然增加了氮吹的时间，但能够充分保证免疫亲和柱与抗体结合的黄曲霉毒素B1能够完全洗下来，提高回收率。

2.2.2 实验注意事项

免疫亲和柱从冰箱中拿出来要放到室温至少要在0.5 h以上。免疫亲和柱内真菌毒素的抗体在20～25 ℃时活性最强，所以样品上柱净化处理的环境温度要控制在20～25 ℃。最后用甲醇洗脱时，第1 mL甲醇加进去后，先把免疫亲和柱的下端口堵住，温育几分钟。氮吹结束用1 mL甲醇定容时要充分均匀，让氮吹管壁上的黄曲霉毒素B1充分溶于甲醇中[3]。

做加标回收，不要马上加标提取，充分混匀放置过夜，让标液有充分的时间和样品混合，增加基质的干扰，增加提取的难度。

黄曲霉毒素B1一般在中性溶液中较稳定，但在强酸性溶液中稍有分解，在pH 9～10的强碱溶液中迅速分解成几乎无毒的盐，实验结束后，所有装过AFTB1的瓶子，器皿及AFTB1的残留液均需过pH 9～10的强碱溶液中，使残留液分解成无毒的盐，避免对环境造成污染。

3 结论与讨论

本次实验得到了花生油中黄曲霉毒素B1较为理想的检测方法，此方法可推广到黄曲霉毒素B族和G族的检测，通过实验能够掌握提高免疫亲和柱回收率的几个关键点，对于其他真菌毒素的检测提供了借鉴。

花生油深受广大消费者的喜爱，花生油中含有丰富的不饱和脂肪酸、维生素E等有益成分，经常食用可以降低胆固醇，保护心脑血管[4-5]。花生油虽然营养价值丰富，但也不能长期食用，世界卫生组织、中国粮农组织和中国营养学会等权威机构研究得出，当人体膳食中的饱和脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸的平衡比例达到1∶1∶1时，才是最健康、完美的营养结构。