气相色谱测定甜蜜素方法的优化及探究

◎ 何焜鹏，陈丽香，黄日梅

（1.广东省食品工业公共实验室，广东 广州 511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东 广州 511442；3.广东省食品质量监督检验站，广东 广州 511442）

甜蜜素，化学名称为环己基氨基磺酸钠，属于非营养型合成甜味剂，其甜度为蔗糖的30～80倍[1]，在饮料、蜜饯、酱菜、配制酒等各类食品中广泛使用，而甜蜜素价格仅为蔗糖的1/3，经常食用甜蜜素含量超标的饮料或其他食品，会因摄入过量对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒能力较弱的老人、孕妇、儿童危害更明显[2-4]。目前检测甜蜜素的方法主要参照GB 5009.97—2016中气相色谱法测定，前处理烦琐，容易污染色谱系统，多次进样后色谱柱分离性能变差，出峰位置会受到杂峰干扰，色谱柱寿命变短。采用顶空进样的方式，可减少复杂基质对色谱系统的污染，利用亚硝酸盐在强酸的环境中，生成的亚硝酸与环己基氨基磺酸发生重氮化反应，生成化合物，经过气相质谱定性其成分为环己烯[5]，通过测定其含量进行定量分析，简单高效，结果令人满意。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B气相色谱仪（配置FID检测器，安捷伦科技有限公司）、涡旋振荡器（德国IKA公司）；离心机（曦玛离心机（扬州）有限公司）、G1888顶空进样器（安捷伦科技有限公司）、数显型振荡摇床（德国IKA公司）及气相色谱质谱联用仪（安捷伦科技有限公司）。

环己基氨基磺酸钠标准品，纯度≥99.9%，Dr. Ehrenstorfer生产；硫酸和亚硝酸钠，分析纯，广州化学试剂厂生产；实验室用水为Milli-Q一级超纯水。

1.2 试验方法

1.2.1 溶液配制

硫酸溶液（200 g·L-1）：量取54 mL硫酸小心缓缓加入400 mL水中，后加水至500 mL，混匀。

亚硝酸钠溶液（50 g·L-1）：称取25 g亚硝酸钠，溶于水并稀释至500 mL，混匀。

环己基氨基磺酸标准储备液：准确称取0.561 2 g环己基氨基磺酸钠标准品，用一级纯水溶解后定容至100 mL，混匀后此时得5 mg·mL-1的环己基氨基磺酸溶液（环己基氨基磺酸钠与环己基氨基磺酸的换算系数为0.890 9）。

1.2.2 样品前处理

液体试样：摇匀样品，称取25 g（精确到0.001 g），置于50 mL比色管，用水定容至刻度线待衍生化；固体试样：样品粉碎均匀后，称取5 g（精确到0.001 g），置于50 mL的离心管，加入20 mL水超声30 min，8 000 r·min-1离心3 min，将水相转移至50 mL比色管，分3次每次10 mL洗涤残渣后，用水定容至刻度线。

1.2.3 衍生化

取样液5 mL于顶空瓶，加入2 mL硫酸溶液、2 mL亚硝酸钠溶液后，马上密封顶空瓶。以2 000 r·min-1低速涡旋1 min混匀，待顶空上机测定。

1.2.4 气相色谱条件

色谱柱：DB-5色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱温升温程序：60 ℃保持8 min；进样口温度：230 ℃；进样量：1 mL；分流进样，分流比5∶1，分流流量为12 mL·min-1；氢火焰离子化检测器（FID）：温度250 ℃，氢气 40 mL·min-1；空气 350 mL·min-1；尾吹30 mL·min-1；载气：高纯氮气；尾吹 20 mL·min-1。顶空条件：平衡温度50 ℃，定量环温度90 ℃，传输线区温度100 ℃。

2 结果与分析

2.1 测定化合物分析

本实验利用亚硝酸钠在酸性环境下与甜蜜素反应生成衍生物环己烯，以环己烯作为对目标化合物进行定量定性分析。甜蜜素标准溶液衍生物环己烯的色谱图见图1，通过与空白样品的比较，其保留时间为2.209 min。该化合物经过气相色谱质谱联用仪测定，确定该目标物为环己烯见图2。

图1 环己烯的气相色谱图

图2 环己烯质谱图

2.2 目标化合物的提取方式选择

实验研究了超声提取和振荡提取目标化合物的方法，超声提取的方法见1.2.2，振荡提取的方式是样品置于50 mL离心管，加入20 mL水，置于数显型振荡摇床，振荡30 min，同时用GB 5009.97—2016第一法测定，以市购的一款果冻（标签含甜蜜素）平行测定6次进行检测分析，测定值见表1。从数据得知超声提取测得值与国家标准方法（简称国标）测得值接近，振荡提取测得值与国标结果偏差较大，因此本方法将采用超声的方式提取。

表1 不同提取方式测定果冻中甜蜜素的值表（n=6）

2.3 顶空平衡温度与平衡时间选择

配制5个标准浓度点，浓度均为50 μg·mL-1，控制顶空平衡时间为30 min。顶空进样器可设置的平衡温度范围为40～230 ℃，样品为水溶液，当设置平衡温度过高时，顶空瓶内压力升高或者样品沸腾，可能导致顶空瓶内样品内气体泄漏或者顶空瓶破裂等情况，故本试验在40～80 ℃进行试验探究。统计在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃平衡温度下相同浓度标准点的响应值，用于探究本实验较优的顶空平衡温度，测试结果见图3。配制5个标准浓度点，浓度均为50 μg·mL-1，控制顶空平衡温度为50 ℃，标准浓度点在平衡时间为10 min、20 min、30 min、40 min和50 min下进行测试，统计在不同平衡时间下相同浓度的标准浓度响应值，用于探究较优的平衡温度，测试结果如图4。从图3和图4可得知，当平衡温度为50 ℃时，环己烯达到最大的响应值；当平衡时间为30 min时，环己烯达到最大的响应值。因此，本方法将顶空平衡温度为50 ℃，顶空平衡时间为30 min作为本方法的顶空条件。

图3 顶空平衡温度与响应值关系图

图4 顶空平衡时间与响应值关系图

2.4 方法的线性范围及检出限

从环己基氨基磺酸标准储备液（5 mg·mL-1）中分别吸取0.1 mL、0.2 mL、0.5 mL、1 mL和2 mL用纯水定容至 50 mL，配制成 10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、50 μg·mL-1、100 μg·mL-1和 200 μg·mL-1的 标 准 工作使用液。吸取5 mL于顶空瓶，按1.2.3衍生化，上机测定。以标准工作液浓度为横坐标，环己烯峰面积为纵坐标，绘制校正曲线见图5，线性回归方程为Y=1.201 0X-1.686 0，线性拟合R=0.999 8，线性良好，符合GB/T 27404—2008相关系数的要求。将标准品储备液逐级稀释，以信噪比S/N=3时的浓度为本方法的检出限，为0.06 μg·mL-1，S/N=10时的浓度为本方法的定量限，为 0.2 μg·mL-1。

图5 环己烯的校正曲线图

2.5 样品加标回收实验和重复性实验

从市场购得的多种样品在3个不同添加水平下进行加标回收实验和精密度实验，结果见表2。

表2 不同基质不同添加浓度下甜蜜素的回收率和精密度表（n=6）

甜蜜素在不同添加水平下的回收率为95.6%～104.0%，相对标准偏差为0.3%～3.5%，符合《实验室质量控制范围 食品理化检测》（GB/T 27404—2008）中回收率和精密度的要求。

2.6 检测标准的测定结果比对

从市场购得的多种样品，将本方法结果与GB 5009.97—2016第一法气相色谱法的结果进行比较，平行测定6次。统计数据，确认本方法与标准方法的结果是否有较大差异，结果见表3。从数据得知，在不同基质下，本方法的结果与标准方法相近，相对偏差较小，能满足检测的要求。

表3 多种基质在不同方法下的测定值表（n=6）

3 结论

本方法采用顶空进样方式测定甜蜜素，建立了以环己烯作为目标物进行测定的方法。对样品提取方式、顶空条件的选择、样品回收率及测定稳定性等方面进行了探究。改进了GB 5009.97—2016第一法的前处理步骤。采用顶空进样方式，减少了各种基质中脂类、糖分、蛋白质等物质对色谱系统的污染。目标化合物的线性相关系数良好、样品的加标回收率在正常范围内、精密度小，符合GB/T 27404—2008中的要求。本方法简单高效，适用于检测食品中甜蜜素含量的检测。