微孔板式微生物法与国标微生物法测定 婴幼儿配方乳粉中泛酸含量的比较
2021-06-16郭莹莹李兴霖王玉芝王哲明
◎ 郭莹莹，杨 光，李兴霖，王玉芝，王哲明，赵 平
（黑龙江省质量监督检测研究院，黑龙江 哈尔滨 150028）
泛酸属于水溶性维生素，在体内主要以辅酶A形式参与代谢。泛酸是人、动物及微生物必需的营养物质，作为营养添加剂，被广泛应用于食品中[1-3]。泛酸缺乏时可能诱发脑部受损、头痛、呕吐、疲劳、食欲不振、舌炎、胃酸缺乏和皮炎等，尤其是在婴幼儿发育时期表现明显。婴幼儿配方乳粉作为婴幼儿摄取营养物质的主要来源，各国非常重视，故对维生素添加量的监控十分重要[4-5]。
婴幼儿配方乳粉中泛酸含量测定的方法主要是微生物法和高效液相色谱法，而微生物法灵敏度高、受基质干扰小，是国家标准及AOAC（美国分析化学家协会）方法测定婴幼儿配方乳粉中泛酸含量的指定方法[6]。
微孔板法是利用微生物方法，在微孔板中定量检测婴幼儿配方乳粉中的泛酸含量的方法。相比于国标微生物法，微孔板法具有操作简便、降低成本、提高工作效率的优点[7]。本实验主要通过采用实验室开发的微孔板式微生物法与国标微生物法对质控样品和不同品牌的市售婴幼儿配方乳粉中泛酸含量的测定的比较，来分析实验室开发的微孔板式微生物法在测定婴幼儿配方乳粉泛酸含量中的准确度。
1 材料与方法
1.1 仪器与设备
SQP精密天平（德国Sartorius公司）、KQ5200DE超声仪（昆山市超声仪器有限公司）、PB-10pH计（德国赛多利斯公司）、T6新世纪紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、2266洁净工作台（上海拜艾斯）、MX-S涡旋振荡器（美国Scilogex公司）、HPS-400生化培养箱（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）、PHOMO酶标仪（郑州安图生物股份有限公司）及微量移液器（德国Eppendorf公司）。
1.2 材料与试剂
SRM 1849a质控样品[美国NIST，含量范围（6.82±0.19）mg/100 g]；不同品牌的5种市售婴幼儿配方乳粉；Millex-GP一次性无菌滤器（美国Millipore公司）。
植物乳杆菌ATCC 8014（美国Microbiologics公司）；泛酸钙标准品（99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司）；乳酸杆菌琼脂（美国BD公司）；乳酸杆菌肉汤（美国BD公司）；泛酸测定培养基（北京路桥公司）；无水乙醇（分析纯，天津市天力化学试剂有限公司）。
1.3 国标微生物法
采用《食品安全国家标准食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法对质控样品与5种市售不同品牌婴幼儿配方乳粉中泛酸含量进行测定。每个样品进行7次平行测定，计算平行测定结果及结果间的相对标准偏差RSD。在一个样品中加入标准中间液进行加标回收实验，测定结果并计算回收率。
1.4 微孔板式微生物法
1.4.1 测试菌液的制备
按《食品安全国家标准食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中接种液的制备方法制备测试菌液，并将测试菌液的透光率在550 nm处调节至30%～35%，备用。
1.4.2 标准曲线的制备
参照《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2016）[8]第一法微生物法中标准曲线浓度点设置标准浓度点，见表1。以各标准浓度点吸光度为横坐标，各标准浓度泛酸含量为纵坐标绘制标准曲线。
表1 标准曲线系列浓度表
1.4.3 培养、测定与计算
用8联排微量移液器在微孔板的每个微孔中加入5 μL制备好的植物乳杆菌（ATCC 8014）测试菌液，再用8联排微量移液器移取150 μL已制备泛酸测定培养基于微孔中，用微量移液器移取150 μL系列浓度的标准曲线工作液与适当稀释的样品溶液于指定的微孔中，加液完毕后，用微孔板封口膜封好微孔板，置生化培养箱37 ℃黑暗环境中培养24 h。培养后将微孔板充分振荡混匀，揭开微孔板封口膜，用移液器枪头去除微孔中表面气泡，利用酶标仪在550 nm波长下读取各微孔的吸光度。以吸光度为横坐标、泛酸含量为纵坐标绘制标准曲线，参照《食品安全国家标准 食品中泛酸的测定》（GB 5009.210—2016）[8]中第一法微生物法的计算方法计算样品泛酸含量。
依据本方法，对5种不同品牌市售婴幼儿配方乳粉和质控样品进行泛酸含量测定，每个样品进行7次平行测定，并对一种样品进行加标，测定并计算回收率，通过精密度实验及加标回收实验来评价本方法。
2 结果与分析
2.1 国标微生物法结果
2.1.1 精密度实验结果
5种不同品牌的市售婴幼儿配方乳粉及质控样品中泛酸含量的测定结果见表2，各样品结果间无显著差异，RSD为1.14%～2.34%，方法重现性较好，精密度较高，且定值质控样品的实测值在含量范围（6.82±0.19）mg/100 g内接近于定值，说明国标微生物法准确度较高。
2.1.2 加标回收实验结果
对市售婴幼儿配方乳粉进行泛酸加标，采用国标微生物法对其泛酸含量进行测定并计算回收率，测定结果如表3所示，加标回收率为97.6%～100.3%，平均回收率为98.96%，RSD为1.10%，回收率接近100%，说明国标法的系统误差小，重复性好，准确度高。
表2 国标微生物法精密度实验结果表
表3 国标微生物法加标回收实验结果表
2.2 微孔板式微生物法实验结果
2.2.1 精密度实验结果
微孔板式微生物法测定不同品牌的婴幼儿配方乳粉和质控样品中泛酸含量的实验结果见表4，各样品结果间无显著差异，RSD为1.34%～2.45%，说明本方法具有良好的重现性，精密度较高，且定值质控样品的实测值在含量范围内接近于定值，说明微孔板式微生物法准确度较高。
表4 微孔板式微生物法精密度实验结果表
2.2.2 加标回收实验结果
微孔板式微生物法加标回收实验结果如表5所示，回收率为93.2%～106.3%，平均回收率为101.0%，RSD为4.32%，回收率接近100%说明方法的系统误差小，重复性好，准确度高。
表5 微孔板式微生物法加标回收实验结果表
2.3 方法结果比较
采用两种方法测定不同品牌的婴幼儿配方乳粉中泛酸含量的结果如表6所示，各样品的泛酸含量结果的平均值接近，两方法测定各样品结果经F检验，P＞0.05。采用双样本等方差t检验对两方法各样品结果进行分析P＞0.05，应用两种方法在测定婴幼儿配方乳粉中泛酸含量上无显著差异，说明两种方法相近，微孔板式微生物法可以替代国标微生物法应用于实验室中测定婴幼儿配方乳粉中泛酸含量。
表6 方法结果比较表
3 结论
通过国标微生物法与微孔板式微生物法对5种市售不同品牌的婴幼儿配方乳粉及质控样品中泛酸含量进行测定，结果表明两种方法的准确度较高；且两种方法测定的每种样品的7个平行结果间的RSD值为1.14%～2.34%与1.34%～2.45%，方法重复性较好，精密度较高，且平行结果间均无显著差异；两种方法的平均回收率分别为98.96%与101.0%，都接近于100%，说明方法的系统误差较小。且两种方法测定各样品泛酸含量的结果较接近，经F检验与t检验分析，两方法在测定婴幼儿配方乳粉中无显著差异。结果表明采用的微孔板式微生物法在测定婴幼儿配方乳粉中泛酸含量上与国标微生物法具有相同的效果，结果准确可靠、方法重现性好、系统误差小，能够应用于日常婴幼儿配方乳粉中泛酸含量的测定中，减少工作量，提高工作效率，降低实验成本。
