miR-196a2和miR-499基因多态性与云南汉族人群非小细胞肺癌的相关性*

杨佳， 马千里， 李盈甫， 王莹莹， 李传印， 洪超， 朱小永， 肖云， 谭芳**

(1.中国医学科学院 & 北京协和医学院 医学生物学研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明医科大学第三附属医院 胸外科， 云南 昆明 650118； 3.昆明医科大学第一附属医院 干疗科， 云南 昆明 650032； 4.昆明医科大学 基础医学院， 云南 昆明 650500； 5.昆明医科大学第三附属医院 重症医学科， 云南 昆明 650118)

近年来随着癌症发病率和死亡率不断升高，现已成为一个重要的公共健康问题[1]。肺癌作为全球范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，在中国的发病率和死亡率也很高，且呈逐年上升趋势[1-2]。研究表明，吸烟是肺癌发生的最重要风险因素[3-4]，但只有15%的吸烟者可能会罹患肺癌，这说明其他因素在肺癌的发生中也发挥着重要的作用[5]，尤其是个体遗传因素[6]。微RNA(miRNAs)是一类单链非编码小RNA分子，长度为21～24个核苷酸。miRNAs在真核细胞生物学过程中发挥重要的调控功能，超过60%的人类基因组蛋白编码基因的表达可能会受到miRNAs的调控[7]。人类基因组编码的miRNA分子在不同组织中的特异性表达，在胚胎发育、维持组织和器官正常生理功能中发挥重要作用[8]，在肺癌等大多数的人类肿瘤中均发现了miRNA基因的异常表达[9]。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNPs)是人类基因组中常见的遗传变异，而miRNA基因编码区域的SNPs可能会对miRNA表达及生物学活性产生影响，与多种人类疾病的易感性相关[10]，在对肺癌的研究中，发现了大量与肺癌易感性相关的miRNA基因SNPs位点[11-12]。由于不同研究纳入的人群和样本量的不同，不同相关性研究结果存在不一致的情况，比如2009年Tian等[13]的研究显示，miR-196a2基因的SNPs 位点rs11614913的基因型CC可能会增加肺癌的患病风险；但在2019年Mohamed等[14]则发现该位点基因型CC可能是肺癌发生的保护性因素。因此，为研究miRNA基因中的SNPs与云南汉族人群NSCLC的相关性，本研究选取了miR-196a2和miR-499基因的SNPs位点rs11614913和rs3746444，调查这2个SNPs位点在云南汉族人群NSCLC患者及健康人群中的分布特征，并分析这2个SNPs位点与云南汉族人群NSCLC易感性的关系，报告如下。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1对象及分组 选取2015年10月—2018年5月确诊的415例NSCLC的患者作为病例组，根据世界卫生组织肺癌组织类型划分标准，病例组按病理类型分为鳞癌、腺癌、鳞腺癌及其他类型肺癌；另外，采用国际肺癌临床分期系统进行临床分期，病例组临床分期分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ期。病例组纳入标准为：所有病例均为初次确诊未接受放化疗等抗肿瘤治疗、未患有其他恶性肿瘤、无其他慢性疾病。选取同期体检的健康个体462例为对照组，对照组的纳入标准为：影像学检查未发现肺部占位性病变、无刺激性干咳、血痰、胸痛等症状、未患有其他恶性肿瘤、无其他慢性疾病。所有研究对象均为居住于云南、彼此无血缘关系的汉族个体，年龄23～88 岁。

1.1.2主要试剂和仪器 QIAamp全血基因组 DNA 提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，QIAGENE公司，德国)，基因分型试剂(TaqMan Genotyping Master Mix，ABI公司，美国)，TaqMan探针分型试剂盒(rs11614913探针试剂盒编号为C___731185852_10和rs3746444探针试剂盒编号为C__2142612_40，ABI公司，美国)，ND-2000微量紫外可见分光光度计(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪(ABI公司，美国)。

1.2方法

1.2.1基因组DNA提取 采集空腹静脉血5 mL，用EDTA·K2或肝素抗凝，使用全血基因组DNA提取试剂盒提取 DNA。用超微量紫外可见分光光度计检测DNA的浓度和纯度。

1.2.2基因分型 本研究采用TaqMan探针基因分型法对miR-196a2基因SNPs位点rs11614913和miR-499基因SNPs位点rs3746444进行基因分型。基因分型PCR反应体积为5 μL，包含SNPs分型试剂2.5 μL、TaqMan探针(20×)0.25 μL、样品DNA 1 μL、双蒸水1.25 μL。反应程序为95 ℃ 预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火延伸1 min，共40个循环。每次实验均设置阴性对照(以双蒸水代替DNA模板样本)。使用基因分型软件TaqMan Genotyper Software进行结果分析。同时，每个位点选取3个不同基因型的样本进行测序验证。

1.3 统计学分析

使用SPSS 19.0软件进行数据的统计分析，采用t检验分析病例组和对照组年龄差异，用χ2检验分析病例组和对照组性别差异；PLINK软件计算病例组和对照组中每个SNPs位点的基因型、等位基因频率，哈迪-温伯格平衡(Hardy-Weinbergequilibrium，HWE)评价2组随机样本的群体代表性；使用χ2检验分析病例组和对照组间等位基因和基因型频率的分布差异，使用在线软件SNPStats对2个SNPs位点的5种遗传模式进行分析[包括共显性模式(codominant)、显性模式(dominant)、隐性模式(recessive)、超显性模式(overdominant)和逻辑加性模式(log-additive)]，根据赤池信息量准则(akaikeinformationcriterion，AIC) 和贝叶斯信息准则(bayesianinformationcriterions，BIC) 的数值来确定每个位点的最优遗传模式，即AIC和BIC数值最小的遗传模式为最优的遗传模式。以P<0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象的基本特征

本研究共纳入NSCLC患者415例，平均年龄(55.84±10.70)岁，其中男290例、女125例，按病理类型分为鳞癌患者150例、腺癌患者241例、鳞腺癌及其他类型肺癌患者24例，按临床分期Ⅰ+Ⅱ期患者134例、Ⅲ+Ⅳ期患者281例。对照组462例，平均年龄(5.56±6.75)岁，其中男315例、女147例。病例组和对照组的年龄和性别分布比较，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 rs11614913和rs3746444位点等位基因、基因型与NSCLC的相关性

结果显示，rs11614913和rs3746444位点的基因型在病例组和对照组中的分布均符合HWE定律(P>0.05)，说明本研究的样本是具有群体代表性的随机样本。对2个SNPs位点的等位基因和基因型频率在病例组和对照组中分布特征进行分析后发现， rs11614913和rs3746444位点的等位基因和基因型在病例组和对照组中分布频率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 rs11614913和rs3746444位点的等位基因和基因型在病例组和对照组的分布

2.3 遗传模式分析miR-196a2和miR-499基因2个SNPs位点与NSCLC的相关性

miR-196a2和miR-499基因2个SNPs位点与NSCLC的相关性分析结果显示，对病例组和对照组的rs11614913和rs3746444的最优遗传模式均为超显性遗传模式。在超显性遗传模式中，2个SNPs位点在病例组和对照组中分布频率比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 病例组与对照组SNPs位点rs11614913和rs3746444的遗传模式分析

2.4 rs11614913和rs3746444位点与NSCLC病理类型和临床分期的相关性

结果显示，miR-196a2基因SNPs位点rs11614913和miR-499基因SNPs位点rs3467444可能与NSCLC的病理类型具有相关性，其中rs11614913等位基因C携带者患NSCLC腺癌的风险更高(OR=1.388，95%CI为1.038～1.857，P=0.027)，而rs3467444等位基因G的携带者可能更容易患NSCLC鳞癌(OR=9.713，95%CI为4.054～23.269，P<0.001)。见表3。

表3 SNPs位点rs11614913和rs3746444与NSCLC病理类型和临床分期的关系

3 讨论

有学者认为，肿瘤组织中miRNA的表达异常是肿瘤发生发展的重要因素之一[15]，而miRNA基因中的SNPs位点可能是影响miRNA表达的因素之一[16]。因此，miRNA基因中的SNPs可能是通过影响miRNA基因的表达而在肿瘤发生发展过程中发挥作用。

研究发现，miR-196a2在肺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织[17]。rs11614913是一个位于miR-196a2基因成熟序列的变异位点，该SNPs位点可能与成熟miR-196a2的表达水平相关。近年来，该SNPs位点与肿瘤发生风险的相关性被广泛研究[18-19]，其中有些研究发现该位点基因型CC可能与肺癌风险增加相关[7, 20]，而有些研究提示该位点基因型CC可能是肺癌发生的保护性因素[14]，也有些研究并未发现该位点与肺癌的相关性[21]。本研究结果表明该位点与云南汉族人群NSCLC易感性无关，但分层分析结果显示，该位点可能与NSCLC的病理类型相关。以上研究表明miR-196a2基因中的多态性位点rs11614913与肺癌风险相关性的结果存在不一致，这可能是由于不同研究所选的人群遗传背景以及不同研究纳入的样本量大小不一致造成的。因此，未来仍需要开展更多大样本量的相关性研究以及功能研究，以确定该SNPs位点与肺癌风险的相关性。

研究还发现，miR-499在多种人类肿瘤中发挥抑癌基因的作用[22-22]，可作为肿瘤治疗候选靶标[23]。在肺癌中的研究也发现，miR-499在肺癌发生中发挥抑癌基因作用[24]，且可作为肺癌诊断和预后的标记分子[25]，miR-499基因中的SNPs位点rs3746444不同基因型与成熟miR-499的表达水平有关[26]，这可能是该SNPs位点与肿瘤发生风险相关的原因之一[27]。在肺癌的相关性研究中，Li等[28]的研究显示，rs3746444等位基因C可能是肺癌发生的风险因素。但Vinci和Fan等[17, 29]的研究并未发现该位点与肺癌的相关性。同样，本研究结果也未发现rs3746444与云南汉族人群NSCLC风险具有相关性(P>0.05)，但在分层分析中，发现该位点可能与NSCLC的病理类型具有相关性。

综上所述，本研究虽未发现miR-196a2基因SNPs位点rs11614913和miR-499基因SNPs位点rs3467444与云南汉族人群NSCLC风险具有相关性，但可能与NSCLC病理类型相关。