水族药鸡胚质量控制方法的初步研究*

刘春花， 游景瑞,， 王爱民， 王永林， 陈旭利， 马雪， 郑林， 李勇军**

(1. 贵州医科大学 民族药与中药开发应用教育部工程研究中心 & 省部共建药用植物功效与利用国家重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学 药学院， 贵州 贵阳 550025； 3. 贵州医科大学 贵州省药物制剂重点实验室， 贵州 贵阳 550004； 4. 贵州水族药物开发有限责任公司， 贵州 黔南布依族苗族自治州 558100)

鸡胚为雉科动物家鸡(GallusgallusdomesticusBrisson)干燥胚胎，是水族常用民间药物，其用药史最早可追溯到清朝的中后期，在贵州省黔南州水族民间用药已有100多年的历史，广泛流传于贵州省黔南州南部地区。鸡胚味甘、咸、腥，性温，归脾、胃经，用于体虚赢瘦、骨折、筋伤疼痛等，有温中益气、补精填髓的功效[1-2]。按照水族医药理论，以血肉之品补益肌肉骨骼，据《水族骨伤医药》中记载，小鸡仔具有疗伤生肌的作用，为水族骨伤医药的常用接骨药物[3-5]，现代研究也报道鸡胚参与的方药在治疗骨伤方面具有较好的疗效[5-10]。目前关于鸡胚的质量控制标准较少，限制了其广泛的应用和开发，因此本研究通过对鸡胚药材的性状、显微鉴别、薄层鉴别、检查(水分、总灰分、挥发性盐基氮)及醇溶性浸出物等项目进行研究，初步建立鸡胚质量控制方法，为完善鸡胚的质量标准提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1材料与仪器 超声波清洗仪(上海跃进医用光学器械厂)、XTP-A500多功能粉碎机(永康市红太阳机电有限公司)、EL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)、WP-MP-II-20实验室超纯水机(四川沃特尔科技发展有限公司)、青岛海洋硅胶G板(青岛海洋化工厂分厂)、烟台黄海江友硅胶G板(烟台黄海江友化工厂)、青岛鼎康硅胶G板(青岛鼎康化工厂)、尼康50i显微镜及DS-Fi2成像系统(日本尼康公司)、REPROSTAR3薄层数码成像系统(瑞士CAMAG公司)、DK-98-Ⅱ型水浴锅和DH600BII恒温箱(天津泰斯特仪器有限公司)。

1.1.2试药 鸡胚为家鸡蛋经(37.9±0.5)℃孵化17～18 d除去蛋壳的胚胎，新鲜胚胎示意图见图1。本研究所用鸡胚样品均由贵州省农业科学院提供，批号分别为20160929、20161124及20170302，样品均由贵州医科大学药学院中药民族药标本馆龙庆德副教授鉴定为雉科动物家鸡CallusgallusdomesticusBrisson干燥胚胎，凭证标本存放于贵州医科大学贵州省药物制剂重点实验室。取鸡胚(批号20170302)为对照药材。无水乙醇、95%乙醇、甲醇、水合氯醛、硼酸、碳酸钾、甘油及溴甲酚绿指示剂(国药集团化学试剂有限公司)，三氯甲烷、冰醋酸、丙酮、正丁醇(上海试四赫维化工公司)，茚三酮、甲基红指示剂(上海馨晟试化工科技有限公司)，丙三醇购(天津市致远化学试剂有限公司)，阿拉伯树胶(天津市科密欧化学试剂有限公司)，盐酸(重庆川东化工(集团)有限公司)，无水碳酸钠基准试剂(天津市化学试剂研究所有限公司)，以上试剂均为分析纯。

图1 新鲜鸡胚

1.2 方法

1.2.1性状鉴别 采用直尺和游标卡尺对干燥鸡胚药材的大小进行测量并取平均值，采用看、摸、闻及尝等直观方法对样品的形状、色泽、表面、质地、断面及气味等进行鉴定。

1.2.2显微鉴别 取上述3批鸡胚药材分别粉碎(过4号筛)，得粉末。挑取少许鸡胚药材粉末置于载玻片上，滴加蒸馏水、水合氯醛试液或稀甘油试液等(必要时加热进行透化)，盖上盖玻片，置显微镜下(40×10)观察、测量和拍照。

1.2.3薄层色谱鉴别 取鸡胚药材粉末(过3号筛)1 g，加入70%乙醇溶液10 mL，40 kHZ超声20 min，滤过，收集滤液，即得供试品溶液；另取鸡胚对照药材1 g，同法操作，制备对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部[11]通则0502试验，分别精密吸取上述供试品及对照药材溶液各10 μL，点于同一块硅胶G板上，点成条带状，用正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶3 ∶2)作为展开剂，进行展开，然后取出硅胶板晾干，用茚三酮试液缓慢喷洒在硅胶板上，将硅胶板置于105 ℃下加热，显色，直至条带显色清晰，于日光下检视，拍照。

1.2.4水分测定 参照《中国药典》2015年版四部[11]通则0832水分测定法(第二法烘干法)，取鸡胚药材粉末(过二号筛)2 g，均匀平铺于干燥恒质量的扁形称量瓶中，厚度不超过5 mm，开启瓶盖在100～105 ℃干燥5 h，盖好盖移置干燥器中，放冷30 min，称质量，再在上述温度干燥1 h，然后放冷并称定质量，连续两次干燥的差异值应小于5 mg，如未达到要求，继续上述干燥、冷却和称质量步骤，直至连续两次干燥的差异值小于5 mg，根据减少的质量，计算鸡胚药材中的含水量(%)。

1.2.5总灰分测定 参照《中国药典》2015年版四部[11]通则2302灰分测定法，取鸡胚药材粉末2 g，置炽灼至恒质量的坩埚中，然后称定质量(准确0.01 g)，于加热板或电炉上缓缓碳化，注意避免燃烧，使粉末完全炭化，然后将坩埚和碳化好的样品移至马弗炉中，逐渐升高温度至550 ℃，使其完全灰化并恒重，然后根据残渣质量计算供试品中总灰分的含量(%)。

1.2.6挥发性盐基氮测定 试验采用“中华人民共和国国家标准GB 5009.228-2016食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定 第三法(微量扩散法)”进行。称取鸡胚药材粉末10 g，置于具塞锥形瓶中，加水100 mL，边加边振摇，使试样匀分散于液体中，浸渍30 min，过滤，取滤液即得供试品溶液。然后将水溶性胶(阿拉伯树胶10 g、水10 mL、甘油50 mL及碳酸钾5 g，研匀)均匀涂布于扩散皿的边缘，在扩散皿中央内室加入2%硼酸水溶液1 mL，并滴加1滴混合指示剂(甲基红乙醇溶液 ∶溴甲酚绿乙醇溶液 = 1 ∶5)溶液；在扩散皿外室精密加入供试品溶液1 mL，盖上磨砂玻璃盖，然后迅速加入饱和碳酸钾溶液1 mL，并立刻盖密，于实验台上轻轻转动，使溶液充分混匀；置于(37±1)℃温箱内2 h后，取出，放至室温，用0.01 mol/L盐酸滴定液滴定至混合指示液终点颜色变为紫红色，记录消耗的盐酸体积，同时做试剂空白。按上述同法平行测定2次，计算平均值。盐基氮含量计算公式：X={[(V1-V2) ×c×14]/[m×(V/V0) ×100}。X为试样中挥发性盐基氮的含量(mg/100 g或g/L)，V1为试液消耗盐酸或硫酸标准滴定溶液的体积(mL)，V2为试剂空白消耗盐酸或硫酸标准滴定溶液的体积(mL)，c为盐酸或硫酸标准滴定溶液的浓度(mol/L)，14为滴定1.0 mL盐酸[c(HCl)=1.000 mol/L]或硫酸[c(1/2H2SO4)=1.000 mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量(g/mol)，m为试样质量(g)，或试样体积(mL)，V为准确吸取的滤液体积(mL)。本方法中V=1，V0为样液总体积(mL)；本方法中V0=100。

1.2.7醇溶性浸出物测定 按《中国药典》2015年版四部[11]通则2201浸出物测定法中醇溶性浸出物测定法，取鸡胚药材粉末(过二号筛)2 g，置100 mL的锥形瓶中，精密加入乙醇50 mL，密塞，并称定质量，室温静置1 h后，水浴回流1 h；放冷，称定质量，用乙醇补足减失质量，摇匀，滤过；精密量取续滤液25 mL置蒸发皿中，水浴蒸干，于105 ℃干燥3 h，然后置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量，以干燥品计算供试品中醇溶性浸出物的含量(%)。

2 结果

2.1 性状鉴别

鸡胚药材呈规则块状，长3.3～8.5 cm，宽2.0～6.0 cm。表面棕黄色至黑棕色，被深黄色至暗棕色的柔软羽毛，排列稀疏至致密。质地硬脆、易折断，断面不平坦。夹杂黄色不规则大小不等的块状物，呈脂肪样光泽，摸之有滑腻感，气腥，味微咸。见图2。

注：A批号为20160929，B批号为20161124，C批号为20170302。

2.2 显微鉴别

鸡胚粉末呈黄色至棕黄色。根据3批样品粉末显微特征表现为：羽毛杂色，多呈灰色；羽杆呈竹节状，每节长30～175 μm；羽根中间有空隙，细胞呈长方形排列，长34～87 μm；肌纤维组织排列成片状，纤维多平直或呈微波状，直径1.7～5.5 μm；骨碎片组织呈不规则碎块状，表面有细小裂缝状或圆形空隙，可见小孔状骨陷窝。见图3。

肌纤维组织 骨碎片组织 羽毛

2.3 薄层色谱鉴别

通过对样品提取方法和色谱条件的优化，通过耐用性实验的考察，得到 “1.2.3”项下的最佳条件，按上述薄层色谱鉴别方法，对3批样品进行测定，结果显示特征条带清晰，分离度良好，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的条带，见图4。

注：1为20160929，2为20161124，3为20170302，4为对照药材。

2.4 水分、总灰分、挥发性盐基氮和醇溶性浸出物测定

3批鸡胚药材的水分、总灰分、挥发性盐基氮和醇溶性浸出物结果见表1，结果显示不同批次的鸡胚中水分、总灰分、挥发性盐基氮含量和醇溶性浸出物含量存在一定差异，推测可能与母体的生存环境、饮食以及药材的取样时间有关。

表1 鸡胚的水分、总灰分、挥发性盐基氮和醇溶性浸出物测定结果

3 讨论

鸡胚作为黔南地区具有典型民族特色的药材之一，尤其在治疗骨伤方面发挥着重要的作用，具有良好的开发和应用前景。但是目前关于鸡胚质量控制的相关报道较少，为进一步促进鸡胚药材的应用，建立其质量控制标准具有十分重要的意义。

性状鉴定作为一种传统的鉴定手段，经过我国中医工作者长期积累的经验总结，具有简单、直观、快速的优点[12-14]，于是本研究首先对鸡胚药材的性状特征进行了描述。中药显微鉴定是中药材鉴别的主要方法之一，主要利用显微技术确定中药品种和质量[15-19]，具有快速、专属性强和成本低等特点，因此本研究通过粉末制片观察到明显的特征，如灰色的羽毛、竹节状的羽杆、中空的羽根、片状的肌纤维组织、表面有空隙及陷窝的不规则骨碎片组织等，这些都可作为鸡胚鉴定的依据。

薄层色谱鉴别中，本研究通过考察不同提取溶剂(三氯甲烷、70%乙醇、95 %乙醇、甲醇、95%乙醇)，不同显色与检视方法，结果表明70%乙醇为提取溶液，点样、展开后，茚三酮试剂显色后信息丰富，故选择70%乙醇为提取溶剂，茚三酮试剂加热显色后日光下观察作为检视方法。鸡胚属于动物药类，其含有丰富的氨基酸类成分，因此采用正丁醇-冰醋酸-水系统作为展开剂，为了能使样品中的斑点具有良好的分离度，考察了不同比例的正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水(8 ∶2 ∶2、8 ∶3 ∶3、8 ∶2 ∶3、8 ∶3 ∶2)对样品的展开效果，结果显示，展开剂为正丁醇 ∶冰醋酸 ∶水为8 ∶3 ∶2时，显色后信息丰富，条带Rf值适中，故选择此比例为展开剂。不同来源的薄层板于不同温、湿度下的色谱图条带均清晰，表明该方法适用性好，不同厂家来源的硅胶G板均能较好的鉴别鸡胚药材，同时相对湿度和温度对该方法的影响不明显。同一批鸡胚药材供试品溶液制备后，于室温放置3 d后的色谱图前后无明显差异，说明该样品稳定性良好。于是采用上述建立的薄层色谱法对3批鸡胚药材进行鉴定，结果显示各批次药材主条带明显、清晰、分离度良好，同时与对照药材主条带颜色和位置保持一致，进一步说明该方法专属性好，可用于不同批次鸡胚药材的有效鉴别；然而不同产地鸡胚药材中主条带颜色深浅存在差异，提示不同批次鸡胚药材中该类成分含量可能不同，这可能与受精卵的来源及其具体孵化时间有关，具体原因还有待进一步研究。

鸡胚药材通常置通风干燥、防霉、防蛀的条件下，考虑到鸡胚药材贮藏期间易霉变和虫蛀，因此，制定水分测量，最终暂定水分不得过10.0%。总灰分作为评定药材纯度的重要指标，本研究暂定总灰分不超过9.0%。鸡胚富含蛋白质，动物蛋白由于细菌及酶的作用使之腐败分解而产生的游离氨和挥发性羟胺、芳香胺类，如三甲胺、尸胺、酪胺、色胺、吲哚等挥发性碱性物质，为确保临床用药安全，对挥发性碱性物质的检查是控制其质量的一项重要内容[20-23]。本研究结果显示，鸡胚中挥发性盐基氮的含量0.25 mg/100 g远小于“GB2707-2016 国家食品安全标准鲜(冻)畜、禽产品”中规定的15 mg/100 g限度以及“DBS 32/007-2016 江苏省食品安全地方标准 熟制鸡胚蛋(活珠子)”中规定的10 mg/100 g，故本品质量标准中暂不考虑列入挥发性盐基氮的检查。由于鸡胚在民间常用乙醇加工处理后用药，因此选择研究醇溶性浸出物。根据结果暂定本品醇溶性浸出物不得少于15.0%。

综上所述，本研究中鸡胚粉末的显微鉴别和薄层色谱鉴别方法可作为快速鉴别正品鸡胚药材提供依据，同时水分、总灰分检查和醇溶性浸出物测定为控制鸡胚药材的质量提供了参考。