联合GEO数据库使用网络药理学探讨四妙勇安汤治疗类风湿关节炎的作用机制

李院魏　高骥　李双印

【摘 要】目的：联合GEO数据库使用网络药理学探讨四妙勇安汤治疗类风湿关节炎的主要成分和可能的作用机制。方法：通过GEO芯片数据挖掘OMIM数据库和Genecards数据库，检索收集类风湿关节炎靶点;通过TCMSP数据库，以生物利用度 > 30%，类药性 > 0.18为筛选条件，收集四妙勇安汤的活性成分及对应靶点。将四妙勇安汤靶点与类风湿关节炎靶点进行匹配获取靶点基因，使用Cytoscape 3.7.2软件构建蛋白-蛋白相互作用网络，并进行拓扑分析筛选核心靶点。使用R软件进行GO分析和KEGG通路分析。结果：四妙勇安汤有效成分共126个（如山柰酚、槲皮素、豆甾醇、β-谷甾醇、谷甾醇等），对应靶点2044个;类风湿关节炎靶点4360个;中药-疾病靶点匹配获得潜在靶点165个。GO分析生物过程获得通路2329个，细胞组分获得通路89个，分子功能获得通路163个;KEGG通路分析共获得通路160个。结论：本研究为更深层次探究四妙勇安汤及所含四妙勇安汤药物成分方剂治疗类风湿关节炎作用机制奠定了基础。

【关键词】 类风湿关节炎;四妙勇安汤;网络药理学;信号通路;靶点;蛋白-蛋白相互作用网络

On the Mechanism of Simiao Yong'an Tang（四妙勇安汤）in Treating Rheumatoid Arthritis Using Network

Pharmacology Combined with GEO Database

LI Yuan-wei，GAO Ji，LI Shuang-yin

【ABSTRACT】Objective：To explore the main components and possible mechanism of Simiao Yong'an Tang（四妙勇安汤）in the treatment of rheumatoid arthritis（RA）using network pharmacology

combined with GEO database.Methods：GEO chip database was used to mine the OMIM database and Genecards database，which were used to collect rheumatoid arthritis targets.Through TCMSP database，the bioactive components and corresponding targets of Simiao Yong'an Tang were collected under the screening conditions of bioavailability being over 30% and generic property over 0.18.The Simiao Yong'an Decoction target was matched with rheumatoid arthritis target to obtain target gene.The PPI network was constructed using software Cytoscape 3.7.2，and the core target was screened by topology analysis.Software R was used to analyze GO biological function and KEGG pathway enrichment.Results：There were 126 effective components in Simiao Yong'an Tang（such as kaempferol，quercetin，stigmasterol，β-sitosterol，sitosterol etc.）.There were 2044 corresponding targets，4360 rheumatoid arthritis targets and 165 potential targets obtained by Chinese medicine-disease target matching.Go analysis showed that there were 2329 pathways in biological process，89 pathways in cell component and 163 pathways in molecular function.A total of 160 pathways were obtained by KEGG pathway analysis.Conclusion：This study laid a foundation for further exploring the mechanism of Simiao Yong'an Tang in the treatment of rheumatoid arthritis.

【Keywords】 rheumatoid arthritis;

Simiao Yong'an Tang（四妙勇安湯）;network pharmacology;signal pathway;targets;PPI network

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀关节为主要表现的全身性自身免疫性疾病。主要累及关节，也会出现类风湿性结节、肺部受累血管炎，以及全身合并症等关节外表现[1]。RA属中医学“尪痹”“历节病”“痹病”等范畴。RA急性期红肿热痛与中医的热痹极其相似。中医学认为，毒热之邪注于经络，流入关节，使气机阻滞，血运不畅，导致红肿热痛。房定亚[2]提出运用四妙勇安汤治疗RA急性期热痹证。徐国山等[3]研究表明，在西药基础上联合四妙勇安汤类方治疗RA可增强疗效并减少不良反应。四妙勇安汤清热活血，尤其是RA急性期瘀热痹阻证，临床疗效显著。

西医临床常用药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和改善病情抗风湿药（DMARDs）。传统的DMARDs[如甲氨蝶呤、Janus激酶（JAK）抑制剂等]或生物来源的DMARDs（如肿瘤坏死因子抑制剂、共刺激调节剂、白细胞介素-6抑制剂等）[4]，虽然治疗RA疗效显著，但存在一定的不良反应，且JAK抑制剂等新型药物价格高，患者难以承受。

四妙勇安汤联合西药治疗RA效果显著[3]，但其作用机制尚未明确。本文使用网络药理学方法挖掘现有数据库对其作用机制进行探讨，为四妙勇安汤及其类方治疗RA的研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 筛选RA对应靶点 登录美国国家生物技术信息中心（NCBI）选择Gene Expression Omnibus（GEO）数据库，以“rheumatoid arthritis”为关键词搜索相关芯片，获取编号为GSE93272的芯片数据原始文件和GPL570-55999的芯片基因注释文件，此芯片数据中包含275个样本，其中232个来自RA患者（试验组），43个来自健康人群（对照组）。使用R软件（https：//www.r-project.org/，version 3.6.2）对数据进行处理，以|logFC| > 0.5，P < 0.05为过滤条件获取差异基因，即RA相关基因。按照P值筛选前20个差异基因绘制基因热图。登录在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org/）和Genecard（https：//www.genecards.org/），以“rheumatoid arthritis”为关键词检索获取RA相关基因。最终整理汇总获取RA有效靶点。

1.2 四妙勇安汤有效成分及对应靶点的筛选 通过中药系统药理学数据库及分析平台（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）对四妙勇安汤中的金银花、玄参、当归和甘草的有效成分及靶点进行筛选，以生物利用度（OB）> 30%，类药性（DL） > 0.18为筛选条件，获得4味中药的有效成分及对应靶点。登录蛋白质数据库（Uniprot Database，https：//www.uniprot.org/）对所获得的基因进行标准化命名。

1.3 中药复方调控网络及PPI网络的构建 将获取的RA靶点基因与四妙勇安汤有效靶点进行数据对比，预测中药对RA有效的作用靶点，通过Cytoscape 3.7.2软件进行可视化。利用Cytoscape中的Bisogenet插件进行蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建，通过CytoNCA插件进行网络拓扑分析，以度中心性（DC） > 61，介数中心性（BC） > 600进行过滤，得到PPI网络。

1.4 GO和KEGG分析 通过R软件中的Cluster Profiler[5]对四妙勇安汤和RA交集基因进行基因本体论（GO）[生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）]分析，京都基因和基因组百科全书（KEGG）通路分析，对P值进行FDR矫正，设置阈值校正P < 0.05，使用R软件进行绘图。通过Cytoscape软件构建KEGG与核心基因关系网络，根据连接节点的数量多少设置每个节点的大小，做可视化处理。

2 结 果

2.1 RA对应靶点 通过GEO芯片数据分析获得对照组和RA差异基因，以|logFC| > 0.5，P < 0.05为过滤條件，共获得238个差异基因。使用R软件绘制热图，见图1。OMIM数据库获取RA靶点48个。Genecard数据库获取RA靶点4157个。整理后共获得4443个靶点基因，删除重复基因83个，保留4360个靶点基因。

2.2 四妙勇安汤有效成分及对应靶点 登录TCMSP数据库依次检索4味中药，以OB > 30%，DL > 0.18为检索条件获取金银花有效成分23个，玄参有效成分9个，当归有效成分2个，甘草有效成分92个，其中山柰酚、槲皮素为金银花、甘草的共有成分，豆甾醇为金银花、当归的共有成分，β-谷甾醇为金银花、当归、玄参的共有成分，谷甾醇为玄参、甘草的共有成分，及其相对应的靶点共2355个。登录蛋白质数据库对所获得的靶点基因进行标准化命名，去除重复靶点和无法匹配的靶点，最后获得2044个靶点。

2.3 中药复方调控网络的构建及CytoNAC网络拓扑分析 将获取的RA相关靶点和四妙勇安汤靶点进行匹配，获得四妙勇安汤治疗RA的潜在基因165个。通过Cytoscape软件进行四妙勇安汤调控RA网络构建，见图2。

通过Cytoscape软件中的Bisogenet插件，选择数据库包括DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINI、BIND，进行PPI网络构建。使用Cytoscape软件中的CytoNCA插件进行拓扑分析，获得7644个节点。以DC > 61过滤获得1549个节点;继续以BC > 600依次过滤，最终获得733个节点。依据BC值排名靠前的有神经营养因子受体络氨酸激酶1（NTRK1）、肿瘤蛋白质P53（TP53）、Cullin 3（CUL3）、雌激素受体1（ESR1）、泛素C（UBC）、微染色体维护复合体组分（MCM2）、细胞周期蛋白依赖性激酶2（CDK2）、表皮生长因子受体（EGFR）等。

2.4 GO分析 使用R软件对四妙勇安汤和RA的交集基因进行GO分析，包括BP、CC、MF，以校正P < 0.05为过滤条件，BP获得通路2329个，CC获得通路89个，MF获得通路163个，筛选前20个做图，见图3。

2.5 KEGG通路分析 使用R软件对四妙勇安汤与RA交集基因进行KEGG通路分析，设置校正P < 0.05过滤条件，获得通路160个。使用R软件对富集程度较高的前20个通路进行可视化，见图4。通过Cytoscape软件构建KEGG与核心基因关系网络，根据连接节点的数量多少设置每个节点的大小，做可视化处理，见图5。其中DC较高的基因有丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1，17个）、MAPK3（17个）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1，17个）、癌基因同源物A（RELA，15个）、螺旋环螺旋结构域扩散激酶（CHUK，14个）、IκBκB（14个）、MAPK8（13个）、MAPK10（13个）、B淋巴细胞瘤-2相关X蛋白（BAX，13个）、RAF1（12个）、核转录因子-κB抑制蛋白（NFκBIA，12个）等。

3 讨 论

RA是一种自身免疫性炎性风湿病，影响许多组织和器官，引起慢性滑膜炎症，最终导致关节破坏、慢性残疾和预期寿命缩短[6]。近年来，国际新型药物肿瘤坏死因子（TNF）抑制剂、JAK通路抑制剂等的研发和投入临床，虽取得了良好的疗效，但是由于药物使用的局限性（如肿瘤、感染等患者不宜使用）和使用后的不良反应，RA的临床治疗方法仍需不断探索。中医学认为，RA的病因包括正虚与邪实两个方面，正虚是发病的根本原因，主要为营卫不和、气血不足、脾胃虚弱、肝肾亏虚等内在因素;邪实是发病的重要条件，多指风、寒、湿、热等六淫之邪[7]。RA急性期的炎症反应如红肿热痛、皮下结节、红色皮疹、身热、烦躁、口干、溲黄正是热盛成毒，湿郁化浊，二邪交结，阻滞气血所致。四妙勇安汤对于毒热痹阻、灼伤血脉的病机具有极强的针对性，且该方免疫调节机制又为其用于治疗RA提供了充分的理由[8]。

已有研究显示，山柰酚是一种天然黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗炎等多种治疗作用[9]。由于其抗炎特性，可能被用于治疗许多急慢性炎症引起的疾病，包括椎间盘退变、结肠炎、绝经后骨质流失和急性肺损伤。此外，它对癌症、肝损伤、肥胖和糖尿病均有益处，能抑制血管内皮炎症，保护脑神经和心脏功能，并可能用于治疗纤维增生性疾病，包括增生性瘢痕[10]。槲皮素是已知抗氧化活性的自由基清除和抗过敏特性的特点是刺激免疫系统，抗病毒活性，抑制组胺释放，减少促炎细胞因子的产生，并抑制白细胞介素（IL）-4的产生;改善Th1/Th2平衡，抑制抗原特异性免疫球蛋白E抗体形成;对脂氧合酶、嗜酸性粒细胞和过氧化物酶等有抑制作用，对炎症介质有抑制作用[11-12]。

β-谷甾醇具有抗氧化剂、促血管生成、免疫调节、抗糖尿病、抗炎、抗癌和镇痛等作用，且无明显的不良反应[13]。

在人类培养细胞中进行的全基因组基因敲除筛选显示，CUL3对细胞活力有重要意义[14]，这表明CUL3甚至在内皮细胞的维持中也起着至关重要的作用。另一篇文献中也提到，CUL3的E3泛素连接酶（CRL）可以参与广泛的细胞内事件和调控机制，包括受体交叉信号传递、基因表达的表观遗传调控和细胞-细胞连接构成[15]。雌激素受体1（ESR1）與骨质疏松易感性有关[16-21]，这可能与RA后期导致关节骨质破环有关。通过抑制CDK1、CDK2、CDK4、CDK7，可以阻止细胞周期的G1或G2期的细胞周期进程，减缓细胞炎症，增殖和多种慢性疾病的发生[22]。

GO和KEGG通路分析富集结果显示，氧化应激过程与炎症和炎症反应的联系密切[23]。已有研究表明，TNF和IL-17等炎症通路与RA发病密切相关[18-19]。RA急性期的炎症反应明显，四妙勇安汤可能通过影响氧化应激生物过程干预急性期的炎症反应，缓解症状。氧化还原反应（ROS）分子还参与信号转导途径和依赖氧化还原调控一系列生物活性，类如骨髓来源的抑制细胞（MDSCs），这些异源髓样细胞受ROS控制，但它们也使用ROS实现抑制功能[24]。诸如慢性炎症、感染和癌症之类的病理状况会诱导MDSCs，MDSCs由未成熟髓细胞的异质群体组成[25-26]。流体剪切应力和动脉粥样硬化通路，有文献表明，生理层流切变可以促进细胞在流动方向上的伸长和定向，从而抑制增殖，刺激抗炎基因的表达并抑制炎性途径的表达[27]。现有临床试验表明，TNF、IL-6，以及可能的粒细胞-单核细胞集落刺激因子对RA的发病过程至关重要[28]。

综上所述，四妙勇安汤可能是通过多种活性成分，如山柰酚、槲皮素、β-谷甾醇等，调控RA相关基因CUL3、ESAR1、CDK，通过氧化应激过程、ROS等生物过程，进一步调控多种信号通路，如年龄-愤怒信号通路、前列腺癌、流体剪切应力和动脉粥样硬化通路、TNF、IL-17信号、JAK-STAT信号传送途径等通路抑制炎症反应和干预免疫调节，综合作用机体治疗RA。本文通过网络药理学对四妙勇安汤治疗RA的作用机制进行探讨，可为临床应用四妙勇安汤及其类方治疗RA提供理论依据。

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收稿日期：2021-02-25;修回日期：2021-03-28

作者单位：郑州市第三人民医院，河南 郑州 450000

通信作者：李院魏 河南省郑州市管城区南顺城街136号，964564470@qq.com，（0371）66905254