下调miR-711靶向促进SIRT6表达抑制LPS诱导心肌细胞凋亡的影响和机制研究

王艳 颜治 詹洮

心肌细胞凋亡是多种心血管系统疾病发生的重要原因，其也是心肌炎、心肌梗死等心脏相关疾病进展程度的评价指标[1]。脓毒症心脏损伤是常见的心血管系统疾病，脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分之一，也是脓毒症发生的诱导因子[2]。miRNA是近些年来备受青睐的分子生物学标记物，其不仅是评估心血管系统疾病患者预后情况、进展程度的重要指标，也是疾病治疗的潜在靶点[3]。研究显示，miRNA在血管内皮细胞、心肌细胞、平滑肌细胞等各种类型细胞中表达，并且与细胞正常生理功能发挥有关[4]。miR-711在人体内脾脏、肝脏、心脏、肾脏等组织中表达，参与急性肝损伤、肿瘤、心肌纤维化等疾病发生[5]。研究报道显示，miR-711在心肌缺血再灌注损伤、心肌梗死发生时表达上调，并且下调miR-711表达可以减少缺氧诱导的心肌细胞凋亡，miR-711可能是一个心肌细胞促损伤因子[6,7]。目前对miR-711在脓毒症心肌细胞凋亡中的作用及调控机制还不明确。本次实验以心肌细胞H9c2为体外实验对象，探讨miR-711在LPS条件下心肌细胞凋亡中的作用和靶向调控机制，以期为靶向基因改善脓毒症心肌损伤提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料 心肌细胞H9c2购自上海酶研生物细胞库；inhibitor control、miR-711 inhibitor购自广州市锐博生物科技有限公司；LPS购自上海一研生物科技有限公司；Bax抗体购自武汉艾美捷科技有限公司；Bcl-2抗体购自北京百奥莱博科技有限公司；沉默信息调节因子2相关酶6(silent information silent information regulation 2 homolog-6,SIRT6)抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；SIRT6 siRNA、siRNA control均由吉满生物科技(上海)有限公司构建合成。

1.2 细胞分组处理 心肌细胞分为Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS组。Control组：为空白对照细胞；LPS组：细胞以25 mg/L的LPS细胞培养液培养；Anti-NC+LPS组：在细胞中转染inhibitor control，以25 mg/L的LPS细胞培养液培养；Anti-miR-711+LPS组：在细胞中转染miR-711 inhibitor，以25 mg/L的LPS细胞培养液培养。心肌细胞培养液为：添加10%胎牛血清的DMEM。细胞生长密度达到60%时，按照转染试剂Lipofectamin 2000操作说明将inhibitor control、miR-711 inhibitor分别转染到心肌细胞中。

1.3 Realtime PCR检测miR-711表达 收集培养1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS组细胞，添加Trizol试剂提取细胞RNA，RNA溶解在无RNase水中，保存在-80℃。逆转录合成cDNA，逆转录引物为：5’-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGGTTTTTTTTTTTTC-3’，逆转录体系为：0.1%的BSA溶液2 μl、2×miRNA Reaction buffer mix溶液10 μl、miRNA Primescript RT Enzyme mix溶液2 μl、总RNA 1 μl，最后加RNase free dH2O补足至20 μl。逆转录反应条件为：poly(A)加尾反应以及逆转录反应(37℃孵育60 min×2)，逆转录酶失活反应(85℃孵育5 s)。Realtime PCR引物如下：上游5’-ACTTTGAGTCTCTCCTCAGGGTG-3’，下游5’-TCTCCCCTCACTTACGTCTCTCCC-3’，以U6作为内参，进行Realtime PCR反应，反应体系如下：SYBR Green Premix溶液10 μl、上下游引物各0.8 μl、cDNA模板2 μl，最后加ddH2O补足至20 μl，PCR反应程序为：预变性(95℃孵育30 s)、变性(95℃孵育20 s)、退火延伸(60℃孵育20 s)，共40个循环。以2-ΔΔCt法计算miR-711表达量。

1.4 MTT测定细胞活力 按照Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS组分组处理方法将细胞接种到96孔板内，每孔100 μl，放在37℃培养箱内培养1 d。取出培养板，添加体积为20 μl的MTT工作液，继续孵育4 h。把孔内上清溶液弃掉，添加150 μl的DMSO溶液，震荡反应10 min。酶标仪上测定每个孔的吸光度值(Absorbance，A值)。

1.5 流式细胞术测定细胞凋亡 收集培养1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS组细胞，以PBS洗涤细胞，1 000 g离心10 min，将上清吸弃后添加200 μl的结合缓冲液，再加入Annexin V-FITC溶液10 μl、PI溶液5 μl，置于室温条件下结合反应15 min。添加300 μl的结合缓冲液混合后，用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡变化。

1.6 Western blot测定Bax、Bcl-2蛋白表达 收集培养1 d以后的Control、LPS、Anti-NC+LPS、Anti-miR-711+LPS组细胞，用冰预冷后的PBS溶液将细胞轻轻洗涤3次，添加细胞裂解溶液，在冰上静置反应30 min。收集细胞裂解溶液，12 000 g离心20 min，将上清收集至EP管中，保存在-80℃。分别配制10%的分离胶以及5%的浓缩胶，在加样孔内添加40 μg蛋白。蛋白样品在上样之前需要与上样缓冲液混合煮沸5 min。电泳电压设置为恒压100 V，肉眼观察蓝色染料快要跑出玻璃板底部边缘时终止电泳。采用半干式进行电转，以2.5 mA/cm2恒流转膜。转膜结束后取出NC膜，以5%的脱脂奶粉将非特异性结合位点封闭，然后放在一抗溶液中反应2 h，最后放在二抗溶液中孵育2 h。一抗均以1∶800稀释，二抗以1∶2 000稀释。采用ECL显色试剂盒显色。β-actin作为参照，根据条带的灰度值分析目的蛋白表达量，灰度值分析用Image J。

1.7 miR-711靶基因预测和鉴定 采用生物信息学软件targetscan分析预测miR-711的靶基因，SIRT6的3，UTR端与miR-711有结合位点。利用荧光素酶报告系统鉴定靶向关系。SIRT6 野生型(wt)和突变型(mut)荧光素酶报告载体由重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司构建。把构建好的wt和mut荧光素酶报告载体分别与inhibitor control、miR-711 inhibitor共转染到心肌细胞中，培养1 d后，荧光素酶活性测定试剂盒检测心肌细胞荧光素酶活性。

1.8 SIRT6 siRNA对下调miR-711影响心肌细胞活力和凋亡作用检测 分别将miR-711 inhibitor、siRNA control和miR-711 inhibitor、SIRT6 siRNA共转染到心肌细胞中，以25 mg/L的LPS细胞培养液培养，记为Anti-miR-711+LPS+si-NC和Anti-miR-711+LPS+si-SIRT6组，按照上述步骤用MTT、流式细胞术、Western blot方法测定细胞活力、凋亡和Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白水平。

2 结果

2.1 miR-711 inhibitor下调LPS条件下心肌细胞中miR-711表达水平 与Control组比较，LPS组细胞中miR-711表达水平升高(P<0.05)；与Anti-NC+LPS组比较，Anti-miR-711+LPS组细胞中miR-711表达水平降低(P<0.05)；LPS处理后的心肌细胞中miR-711表达水平升高，miR-711 inhibitor下调LPS条件下心肌细胞中miR-711表达水平。见表1。

表1 miR-711 inhibitor转染前后LPS条件下miR-711表达水平比较

2.2 下调miR-711对LPS条件下心肌细胞活性和凋亡影响 与Control组比较，LPS组细胞活力降低，细胞凋亡率升高，细胞中Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与Anti-NC+LPS组比较，Anti-miR-711+LPS组细胞活力升高，细胞凋亡率降低，细胞中Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；LPS处理后的心肌细胞活性降低，细胞凋亡增加；下调miR-711提高LPS条件下心肌细胞活性并减少细胞凋亡。见图1、2，表2。

图2 Western blot测定Bax、Bcl-2蛋白表达

表2 miR-711 inhibitor转染前后LPS条件下心肌细胞活力(A值)、凋亡率和Bax、Bcl-2蛋白水平

2.3 miR-711靶向调控SIRT6 miR-711与SIRT6的3，UTR端有结合位点，miR-711 inhibitor和wt共转染后的心肌细胞荧光素酶活性升高，miR-711靶向调控SIRT6。见图3,表3。

表3 wt和mut转染后心肌细胞荧光素酶活性变化

图3 miR-711和SIRT6结合位点示意图

2.4 下调miR-711提高LPS条件下心肌细胞中SIRT6蛋白表达 与Control组比较，LPS组细胞中SIRT6蛋白表达水平降低(P<0.05)；与Anti-NC+LPS组比较，Anti-miR-711+LPS组细胞中SIRT6蛋白表达水平升高(P<0.05)。LPS处理后的心肌细胞中SIRT6蛋白表达减少；下调miR-711提高LPS条件下心肌细胞中SIRT6蛋白表达水平。见图4，表4。

图4 Western blot检测miR-711 inhibitor转染后LPS条件下心肌细胞中SIRT6蛋白表达变化

表4 miR-711 inhibitor转染前后LPS条件下心肌细胞中SIRT6蛋白水平

2.5 SIRT6 siRNA逆转下调miR-711对LPS条件下心肌细胞活力和凋亡影响 与Anti-miR-711+LPS+si-NC组比较，Anti-miR-711+LPS+si-SIRT6组细胞活力降低，凋亡率升高，Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2、SIRT6蛋白表达水平降低。SIRT6 siRNA逆转下调miR-711对LPS条件下心肌细胞活力和凋亡影响。见图5、6，表5。

图5 流式细胞术测定细胞凋亡

图6 Western blot测定Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白表达

表5 miR-711 inhibitor、SIRT6 siRNA转染前后LPS条件下心肌细胞活力(A值)、凋亡率和细胞中Bax、Bcl-2、SIRT6蛋白水平

3 讨论

LPS又称为内毒素，是引起脓毒症心肌损伤的重要因子[8]。LPS可以诱导心肌细胞凋亡，这也是多种感染性心肌相关疾病发生的机制之一[9]。Bax和Bcl-2均属于Bcl-2蛋白家族成员，二者均参与细胞凋亡过程，Bax具有促进细胞凋亡的作用，而Bcl-2具有抑制细胞凋亡的作用[10]。本次实验结果表明，LPS处理后的心肌细胞活力下降，细胞凋亡水平升高，Bax蛋白表达水平上调，Bcl-2蛋白表达水平下降，提示LPS诱导心肌细胞凋亡，这与上述研究结果相符合，说明成功构建了LPS诱导心肌细胞凋亡模型。

miRNA是一类短链小RNA，其可以在转录后水平影响靶基因的表达，miRNA在机体能量代谢、组织发育、疾病进展等过程中发挥多种生物学作用[11]。miRNA参与心脏发育，并且与心脏疾病发生有关[12]。miR-711属于内含子miRNA，其在人和鼠之间只有2个碱基不同，属于相对保守的miRNA[13]。miR-711与细胞凋亡、生长、纤维化有关，参与肿瘤外泌体、心血管系统疾病、炎症以及内分泌相关疾病进程[6,14-16]。研究报道显示，miR-711在心肌缺血损伤中表达上调，抑制miR-711具有减少心肌细胞凋亡的作用[6,7]。本次实验表明，LPS处理后的心肌细胞中miR-711表达水平升高，并且下调miR-711可以提高心肌细胞活力，减少细胞凋亡和Bax蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达，提示下调miR-711可以抑制LPS诱导的心肌细胞凋亡，miR-711可能是LPS心肌损伤的促进因子。

miRNA在经过非编码区转录以后产生pri-miRNA分子，pri-miRNA在细胞核内经过双链RNA核酸酶特异性处理以后能够形成pre-miRNA发夹结构，pre-miRNA转运至细胞质并经核酸酶剪切加工为成熟的miRNA[17]。miRNA通过与其靶mRNA复杂作用而发挥多种功能[18]。本次实验显示，miR-711靶向负调控心肌细胞中SIRT6表达，miR-711作用机制可能与SIRT6有关。SIRT6是沉默信息调节因子2的同源蛋白，其具有ADP-核酸转移酶以及去乙酰化酶活性，在DNA修复、炎症、基因组稳定、代谢、衰老等过程发挥作用[19，20]。SIRT6与心血管系统疾病有关，在心肌肥大、心力衰竭、心肌纤维化、心肌缺血再灌注等心脏疾病中发挥作用，SIRT6能够明显改善心肌细胞损伤[21，22]。本次实验表明，下调SIRT6可以逆转下调miR-711对LPS条件下心肌细胞凋亡的抑制作用，这进一步证实下调miR-711抗LPS心肌细胞凋亡与靶向促进SIRT6表达有关。

以上表明，下调其表达可以提高LPS条件下心肌细胞活力，减少细胞凋亡，作用机制与促进SIRT6表达有关，miR-711在脓毒症心肌细胞凋亡中可能发挥促进作用，靶向抑制miR-711可能是脓毒症心肌损伤治疗的途径。本次实验为研究miR-711在心血管系统疾病发生中的作用和机制提供了资料，今后会在体内进一步探讨miR-711的功能和机制。